凝胶过滤层析法别离血红蛋白凝胶过滤层析法别离血红蛋白化学生物学实验药学院药学院 化学生物学教研室化学生物学教研室1.实验目的目的初步了解凝胶过滤层析法的简单原理及应用初步掌握应用凝胶过滤法别离蛋白质 1 22.实验原理原理 层析法是利用混合物中各组分物理经学性质的差异如吸附力、溶解度、分子形状、大小和极性等，使各组分以不同的程度分布在两相中，从而使各组分以不同的速度随流动相向前流动而到达别离的目的。层析法可分为多种类型，包括分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和层析等。 层析法析法分配分配层析析 离子交离子交换层析析凝胶凝胶过滤层析析 亲和和层析析 2.实验原理原理1 1待别离混合物A、B随流动相通过固定相由于理化性质差异，与两相发生相互作用吸附、溶解、结合等的能力不同，在两相中的分配含量比照不同与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞作用小，移动速度快分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而到达将各组分别离的目的2 23 34 4凝胶过滤层析，主要根据混合物中分子的大小及形状不同，在通过凝胶固定相时，分子的扩散速率各异而到达别离的目的。凝胶颗粒具有多孔性的网状结构，小分子可以进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速率慢阻滞作用大；而大分子那么被排除在外，沿凝胶间空隙随流动相流动，流动短而移动速率快阻滞作用小，比小分子物质先流出层析床，所以凝胶过滤层析又称为排阻层析，分子筛层析，凝胶过滤法操作简例，且操作条件温和，不易引起生物样品变性失活，别离效果好，故广泛应用于蛋白质、酶、核酸的别离提纯包括脱盐、浓盐及分子量的测定等2.实验原理实验原理本本实验通通过sephadexG50层析柱，以蒸析柱，以蒸馏水水为流流动相，相，别离血离血红蛋白蛋白红色，分子量色，分子量约64,500与二硝基氟苯与二硝基氟苯-鱼精蛋白精蛋白鱼精蛋白与二精蛋白与二硝基氟苯硝基氟苯结合后合后为黄色，分子量黄色，分子量为2,000-12,000的混合物，从的混合物，从颜色色的不同即可的不同即可观察到血察到血红蛋白洗脱蛋白洗脱较快，快，鱼精蛋白洗脱精蛋白洗脱较慢。慢。2.实验原理原理3.实验用品实验用品试剂1交联葡聚糖G-502二硝基氟苯3鱼精蛋白40.9%NaCl510%碳酸氢钠695%乙醇 仪器1锥形瓶2层析柱1cm25cm的玻璃柱3铁架台4弹簧夹5细橡皮管长2cm6量筒7小烧杯100ml4.操作步骤操作步骤1 1、凝胶准备：取、凝胶准备：取sephadex G-50 3gsephadex G-50 3g置于锥形瓶中，加蒸馏水置于锥形瓶中，加蒸馏水90ml90ml，于沸水浴中煮沸，于沸水浴中煮沸2 2小时小时( (或放于水中浸泡或放于水中浸泡6 6小时小时) )，充分，充分膨胀凝胶。取出，冷却至室温后备用。膨胀凝胶。取出，冷却至室温后备用。2 2、装柱：关闭下口，向玻璃柱内参加蒸馏水达柱总长度约、装柱：关闭下口，向玻璃柱内参加蒸馏水达柱总长度约1/31/3处，把膨胀好的糊状凝胶边搅拌、边自柱的顶端沿管内壁缓处，把膨胀好的糊状凝胶边搅拌、边自柱的顶端沿管内壁缓缓参加柱中至柱顶部，待柱底部凝胶沉积至缓参加柱中至柱顶部，待柱底部凝胶沉积至1-2cm1-2cm时，开启时，开启柱底部出水口，并控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在柱底部出水口，并控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。再慢慢地继续参加凝胶，直至凝胶体积至柱顶溶液中。再慢慢地继续参加凝胶，直至凝胶体积至柱顶2.5cm2.5cm左右，最好一次连续装完，假设分次装入，需用玻璃左右，最好一次连续装完，假设分次装入，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。装柱长度至少棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。装柱长度至少8cm8cm。最后放入略小于层析柱内径的圆形小滤纸片，以防将。最后放入略小于层析柱内径的圆形小滤纸片，以防将来加样时凝胶被冲起。来加样时凝胶被冲起。4.操作步骤操作步骤3 3、平衡：用、平衡：用10ml10ml左右的蒸馏水流洗整个柱床。操作过程中严防左右的蒸馏水流洗整个柱床。操作过程中严防出现气泡和分层，如床面不平，可用玻璃棒轻轻搅动外表，出现气泡和分层，如床面不平，可用玻璃棒轻轻搅动外表，是凝胶重新自然沉降。整个过程中勿使液面低于床面，以免是凝胶重新自然沉降。整个过程中勿使液面低于床面，以免气体进入，使柱床干裂。气体进入，使柱床干裂。4 4、加样：待柱床面以下的蒸馏水流出，且刚好与床面相切时、加样：待柱床面以下的蒸馏水流出，且刚好与床面相切时( (切不可使床面完全暴露于空气中切不可使床面完全暴露于空气中) )，关闭下口。用滴管取血，关闭下口。用滴管取血红蛋白及鱼精蛋白混合液血红蛋白稀释液红蛋白及鱼精蛋白混合液血红蛋白稀释液3 3滴加滴加DNP-DNP-鱼精鱼精蛋白溶液蛋白溶液3 3滴，十分小心地并缓缓沿内壁参加滴，十分小心地并缓缓沿内壁参加( (注意切勿破注意切勿破坏柱床面坏柱床面) )，翻开柱底部出口，使样品进入床内，至床面重，翻开柱底部出口，使样品进入床内，至床面重新露出时，先参加少量的蒸馏水，冲洗床面新露出时，先参加少量的蒸馏水，冲洗床面1-21-2次，然后再次，然后再参加足量蒸馏水。参加足量蒸馏水。4.操作步骤操作步骤5 5、洗脱和标定：用试管收集洗脱液体。调节流速使液体均、洗脱和标定：用试管收集洗脱液体。调节流速使液体均匀流出约匀流出约1ml/min1ml/min，同时记录如下数据：起始、红始、，同时记录如下数据：起始、红始、红终、黄始、黄终、终止红终、黄始、黄终、终止(1.5(1.5倍柱体积倍柱体积) )。观察血红蛋白。观察血红蛋白与鱼精蛋白的洗脱次序并记录实验现象与鱼精蛋白的洗脱次序并记录实验现象( (注意洗脱过程中注意洗脱过程中随时添加蒸馏水，以免干柱随时添加蒸馏水，以免干柱) )。6 6、清洗：待所有色带流出层析柱后，继续参加蒸馏水并加、清洗：待所有色带流出层析柱后，继续参加蒸馏水并加快流速，清洗层析柱至凝胶洁净呈白色为止。快流速，清洗层析柱至凝胶洁净呈白色为止。7 7、凝胶的回收：将清洗干净的、凝胶的回收：将清洗干净的sephadex G-50sephadex G-50凝胶回收至回凝胶回收至回收容器中。收容器中。8 8、结果处理：观察记录实验现象并加以分析。、结果处理：观察记录实验现象并加以分析。5.本卷须知本卷须知胶膨胀必须彻底，否那么会影响层析的均一性，甚至有使柱破裂的危险。装柱前参加1cm洗脱液，检查柱子。凝胶装柱过程中严防出现气泡和分层，要使液面高于床面，以免气体进入柱床，影响液体在柱内的流动与最终血红蛋白及核黄素混合物质的别离效果。凝胶装柱要一次完成。装凝胶的烧杯不能清洗。看似脏的东西都是凝胶。柱中的凝胶一定要浸没在洗脱液中。加样一定要极其小心而缓慢，以免凝胶被冲起，造成层析结果不佳。上样时滴管末端一定要靠近凝胶柱外表(1cm)、沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱外表。样品上柱后应在凝胶柱外表形成一层薄液层。收集要及时，不能等红褐色物质流出之后再收集(13滴/管)。流速不可太快(约10滴/min)。层析前及层析中要绝对防止干柱现象。始终保持柱内液面高于凝胶外表，否那么水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致别离效果变坏，不得不重新装柱。洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃。6.思考题在向凝胶柱参加在向凝胶柱参加样品品时，为什么必什么必须保持胶面平整？上保持胶面平整？上样体体积为什么不能太大？什么不能太大？请解解释为什么在洗脱什么在洗脱样品品时，流速不能太快或者太慢？，流速不能太快或者太慢？某某样品中含有品中含有1 mg A蛋白蛋白Mr 10,000Da，1 mg B蛋白蛋白Mr 30,000Da，4 mg C蛋白蛋白Mr 60,000Da，1 mg D蛋蛋白白Mr 90,000Da，1 mg E蛋白蛋白Mr 120,000Da，采用，采用Sephadex G75排阻上下限排阻上下限为3,000-70,000Da凝胶柱凝胶柱层析，析，请指出各蛋白的洗脱指出各蛋白的洗脱顺序。序。