第三章第三章 蛋白质蛋白质第一节第一节 概述概述第二节第二节 氨基酸氨基酸第三节第三节 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构第四节第四节 蛋白质的空间结构与功能蛋白质的空间结构与功能第五节第五节 蛋白质的重要理化性质蛋白质的重要理化性质第六节第六节 蛋白质相对分子量的测定蛋白质相对分子量的测定埂蔓扦昼靠局乞陇枯澎旋谨间衣锥石茧酬种治牌嗽圈目旺爽戊母视黍焚彤蛋白质一级结构蛋白质一级结构第一节第一节 概述概述一、一、蛋白质的概念蛋白质的概念二、二、蛋白质的研究简史蛋白质的研究简史三、三、蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成四、四、蛋白质的分类蛋白质的分类五、五、蛋白质的分布蛋白质的分布六、六、蛋白质的生物学功能蛋白质的生物学功能实洪相稠衰蝗浑几赣去圃啃伙瓷渊圾烧优湘纽域零农烛骨兽走谦宴鸣妻于蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的概念蛋白质的概念: :蛋白质是一切生物体蛋白质是一切生物体中普遍存在的，中普遍存在的，由天然氨基酸通过由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子肽键连接而成的生物大分子；其种；其种类繁多，各具有类繁多，各具有定的相对分子质定的相对分子质量、复杂的分子结构和特定的生物量、复杂的分子结构和特定的生物功能，是表达生物遗传性状的一类功能，是表达生物遗传性状的一类主要物质。主要物质。 瘟五喻镣滓夺瘁妆腋沸垒助株匹官亩猪植蕉纸植嗜捧桩谓步屡藩宽潍酒钙蛋白质一级结构蛋白质一级结构v18381838年年 Muller Muller研究了血清、蛋研究了血清、蛋清、蚕丝等物质的元素组成后清、蚕丝等物质的元素组成后, , 发现发现它们均可以用它们均可以用C C4040H H6262N N1010O O1212 来表示来表示, , 命命名为名为“ProteinProtein”, ,并发展成并发展成 “基团基团” 学学说说 。v1919世纪末世纪末 从蛋白质水解产物分离从蛋白质水解产物分离得到了得到了1313种氨基酸种氨基酸, , 基团学说销声匿基团学说销声匿迹。迹。v19021902年年Fischer, Fischer, HofmeisterHofmeister同同时时提出肽键理论。提出肽键理论。v19241924年年Svedberg Svedberg 发明超离心机。发明超离心机。v19301930年代年代 Bergmann Bergmann合成出只含合成出只含L L型型氨基酸的多肽。氨基酸的多肽。v19501950年年PaulingPauling提提出出蛋蛋白白质质的的二二级级结构的基本单位：结构的基本单位：-螺旋和螺旋和-折叠。折叠。v19531953年年SangerSanger确确定定了了牛牛胰胰岛岛素素的的一一级结构。级结构。v19581958年年 Perutz Perutz & & KendrewKendrew用用X X光光衍衍射法确定了肌红蛋白的立体结构射法确定了肌红蛋白的立体结构v19601960年年 Anfinsen Anfinsen证明蛋白质的一证明蛋白质的一级结构决定其立体结构。级结构决定其立体结构。v19801980年代年代 蛋白质工程的兴起。蛋白质工程的兴起。v19971997年年 提出蛋白组学研究的概提出蛋白组学研究的概念。念。v19991999年年 蛋白质芯片技术出现。蛋白质芯片技术出现。铲探屉逸货欧仔困锨葫懦巫神闲埋照止矩封例寥罢漾瘩棱晋岛因董黍桌飞蛋白质一级结构蛋白质一级结构对蛋白质化学有突出贡献的对蛋白质化学有突出贡献的NobelNobel奖获奖获得者：得者：19021902年年 H.E.Fischer H.E.Fischer ( (德，化德，化) ) 肽肽键理论，多肽合成。键理论，多肽合成。19101910年年 A.Kossel A.Kossel ( (德，医德，医) ) 组氨酸、组氨酸、组蛋白的发现，碱基的发现。组蛋白的发现，碱基的发现。19151915年年 W.H.Bragg/W.L.Bragg W.H.Bragg/W.L.Bragg ( (德，德，物物) ) 用用X X射线测定晶体物质结构。射线测定晶体物质结构。19261926年年 T.Svedberg T.Svedberg ( (瑞，化瑞，化) ) 用超用超离心手段决定蛋白质的分子量。离心手段决定蛋白质的分子量。v19461946年年 J.B.Summer J.B.Summer ( (美，化美，化) ) 蛋白蛋白质酶的结晶，证明酶的本质为质酶的结晶，证明酶的本质为PrPr。v19481948年年 A.W.K.Tiselius A.W.K.Tiselius ( (瑞瑞，化化) ) 电泳装置的开发，血清蛋白的研究。电泳装置的开发，血清蛋白的研究。v19521952年年 A.J.P.Martin/R.L.M.Synge A.J.P.Martin/R.L.M.Synge ( (英，化英，化) )分配层析发明，氨基酸的分离。分配层析发明，氨基酸的分离。v19541954年年 L.Pauling L.Pauling ( (美美，化化) ) 蛋蛋白白质质二级结构，抗原抗体反应理论。二级结构，抗原抗体反应理论。v19581958年年 F.Sanger F.Sanger ( (英英，化化) ) 胰胰岛岛素素一级结构的测定。一级结构的测定。v19621962年年 M.F.Perutz/J.C.Kendrew M.F.Perutz/J.C.Kendrew ( (英，英，化化) ) X X射线确定蛋白质的立体结构射线确定蛋白质的立体结构 。v19721972年年 G.M.Edelman/R.R.Porter G.M.Edelman/R.R.Porter ( (美，美，医医) )抗体的化学构造与功能的解明。抗体的化学构造与功能的解明。v19721972年年 W.H.Stein/S.More W.H.Stein/S.More ( (美，化美，化) ) RNaseRNase的一级结构和活性中心的解明。的一级结构和活性中心的解明。v19721972年年 C.B.Anfinsen C.B.Anfinsen ( (美，化美，化) ) 蛋白质的一级结构决定其立体结构。蛋白质的一级结构决定其立体结构。v19981998年年 S.B.Prusiner S.B.Prusiner ( (美，医美，医) ) Prion:Prion:蛋白立体机构的变化导致疾病蛋白立体机构的变化导致疾病 。铸哄额萤缀墨兜歪网撮琵菱肯捆闭砖关闰伺俗卸诛舞塌例处骨渣胖洁款采蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其他 微 量N N的含量平均为的含量平均为16%16%凯氏凯氏（KjadehlKjadehl） 定氮法定氮法的理论基础。的理论基础。磺易闰桌寡占百暂贤圣柳杨僳极病服队怕蝇接族绣纶助舍喻叮懊匹育朋环蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质含量的测定：蛋白质含量的测定： 凯氏定氮法凯氏定氮法 (测定氮的经典方法) 优点：对原料无选择性，仪器简单， 方法也简单； 缺点：易将无机氮(如核酸中的氮) 都归入蛋白质中,不精确。 一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g 蛋白质）；故： 蛋白质含量=氮的量100/166.25晋低仓梧但策船晶誓履倒旬虐巷孤转伦垦孟莹沾膝至核隧急厉揣待蒸西陵蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的分类蛋白质的分类1.1.按照分子组成分类按照分子组成分类 单纯蛋白质单纯蛋白质：水解产物只有氨基：水解产物只有氨基酸。酸。 结合蛋白质结合蛋白质：水解产物中除了氨：水解产物中除了氨基酸外，还有金属离子和其它物质基酸外，还有金属离子和其它物质（辅基）。结合蛋白根据其辅基的不（辅基）。结合蛋白根据其辅基的不同有好多种。同有好多种。 一种单纯蛋白质只能与特定的一一种单纯蛋白质只能与特定的一种或几种辅基结合。种或几种辅基结合。2.2.按照分子形状分类按照分子形状分类 球状蛋白球状蛋白：分子近似球形或卵圆：分子近似球形或卵圆形，易溶解，能结晶。形，易溶解，能结晶。 纤维状蛋白纤维状蛋白：分子纤维状，不对：分子纤维状，不对称。大多数不溶于水。称。大多数不溶于水。3.3.按照生物功能分类按照生物功能分类 活性蛋白质活性蛋白质：参与代谢反应的蛋：参与代谢反应的蛋白质。白质。 非活性蛋白质非活性蛋白质：对生物体起保护：对生物体起保护和支持作用的蛋白质。和支持作用的蛋白质。活性蛋白质分类活性蛋白质分类1. 1. 酶类（酶类（占细胞内蛋白质种类的绝大部分）占细胞内蛋白质种类的绝大部分）; ;2. 2. 运输蛋白运输蛋白; ; 3. 3. 收缩运动蛋白收缩运动蛋白; ;4. 4. 激素蛋白激素蛋白; ;5. 5. 细胞激动素细胞激动素; ;6. 6. 受体蛋白受体蛋白; ;7. 7. 毒素蛋白毒素蛋白; ; 8. 8. 营养贮藏蛋白营养贮藏蛋白; ;9. 9. 防御蛋白等。防御蛋白等。代酚甜前门流玛烦粤度鳖嗽驴肯掐肌微闸跺田汞刷貌壤绣灼危谓狠财漏任蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质占干重 人体中（中年人） 人体 45% 水55% 细菌 50%80% 蛋白质19% 真菌 14%52% 脂肪19% 酵母菌 14%50% 糖类1% 白地菌50% 无机盐7% 植物：主要在种子中含量较高。蛋白质的分布蛋白质的分布人体各组织器官中蛋白质含量人体各组织器官中蛋白质含量（蛋白质（蛋白质g / 100gg / 100g干组织）干组织）器官或组织蛋白质含量器官或组织蛋白质含量体液85心60脾84肝57肺82胰47横纹肌80脑神经45肾72骨骼28消化道63脂肪组织14我国一些谷物主要成分含量我国一些谷物主要成分含量 粮食种类蛋白质/脂肪/糖类/大豆36.317.526豌豆22.781.3554.7绿豆22.251.0856.02花生仁26.2039.222.0油菜籽26.3440.3517.59大米6.551.0577.50小麦9.421.4768.74玉米5.226.1372.4呈短野辈染夫掂不苔孙绑规很窝士凯瞥栅碑幂遂兴阳蹲脐伺篱么啡返烙募蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的生物学功能1.1.生物体的组成成分生物体的组成成分2 2. 催化催化3. 3. 运输运输4. 4. 运动运动5. 5. 抗体抗体6. 6. 干扰素干扰素7. 7. 遗传信息的控制遗传信息的控制8. 8. 细胞膜的通透性细胞膜的通透性9. 9. 高等动物的记忆、识别机构高等动物的记忆、识别机构酶蛋白结构蛋白免疫球蛋白驭鉴亭鹤皮荡畴幽卤蒸绳剃体掩展汞恍抨贫延莫心珊灯念畏擒束揭浮忿删蛋白质一级结构蛋白质一级结构第二节第二节 氨基酸氨基酸一、一、氨基酸的结构特点氨基酸的结构特点二、二、2020种基本氨基酸的分类种基本氨基酸的分类三、三、氨基酸的重要理化性质氨基酸的重要理化性质四、四、氨基酸的分离制备和分析鉴定氨基酸的分离制备和分析鉴定淆罩韩卸角驹妨端仁超宁戚屹陇帮津滦禽秸登耙员邯妄胯梨蒲徐兰剔书赶蛋白质一级结构蛋白质一级结构氨基酸氨基酸 是蛋白质的基本组成单位。是蛋白质的基本组成单位。氨基酸是具有氨基（氨基酸是具有氨基（-NH-NH3 3+ +）或亚氨基）或亚氨基和羧基（和羧基（-COOH-COOH）的有机分子。氨基酸）的有机分子。氨基酸种类多，但构成蛋白质具有遗传密码种类多，但构成蛋白质具有遗传密码的氨基酸只有的氨基酸只有2020种，其通式为：种，其通式为：不带电形式不带电形式 H2NCHCOOHR +H3NCHCOO-R两性离子形式两性离子形式氨基酸的结构特点：(1). 与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸(2). 除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。 注意：注意：氨基酸的构型是以距羧基最近的手性氨基酸的构型是以距羧基最近的手性C C原子为标准（原子为标准（除除GlyGly外外），而糖的构型），而糖的构型是以距羧基最远的手性是以距羧基最远的手性C C原子为标准。原子为标准。蚕赤窝搐监袋称捐姨使临践碎袱椅透记撮哀格擅留里蹋扎铣代蔡樊座花讽蛋白质一级结构蛋白质一级结构氨基酸的分类氨基酸的分类 中性AA（1）按R基团的酸碱性分 酸性AA 碱性AA（2）按R基团的 疏水性R基团AA 电性质分 不带电荷极性R基团的AA 带电荷R基团的AA 脂肪族A（3）按R基团的化学结构分 芳香族AA 杂环族AA人体必需氨基酸有八种：人体必需氨基酸有八种： Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr “ “假假 设设 来来 写写 一一 两两 本本 书书”振枢毁碗闺圈度尿渤歹嗽得睫球扯普钝终钉涂浮志健魂色摘旨蹬碳杰绑挞蛋白质一级结构蛋白质一级结构(一一)氨基酸的一般物理性质氨基酸的一般物理性质常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异(1)(1)溶解性：溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。(2) (2) 熔点：熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。(3) (3) 味感：味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。(4)(4)旋光性：旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)(5)光吸收：光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。TyrTyr、TrpTrp、PhePhe在近紫外光区的最大在近紫外光区的最大吸收峰（吸收峰（maxmax）和摩尔消光系数）和摩尔消光系数v酪氨酸的酪氨酸的 maxmax275nm275nm， 275275=1.4x=1.4x103 ; ;v苯丙氨酸的苯丙氨酸的 maxmax257nm257nm， 257257=2.0x10=2.0x102; ;v色氨酸的色氨酸的 maxmax280nm280nm， 280280=5.6x10=5.6x103; ;功釉蔓摔码肃琼崩眷裹继若弥阳霜祭践澈寸歼栗砂人婿埂坏慑惕隆蝉错铰蛋白质一级结构蛋白质一级结构 氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。 在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。（二）氨基酸的离解性质（二）氨基酸的离解性质如如果果在在某某一一pH pH 值值下下，氨氨基基酸酸所所带带正正电电荷荷的的数数目目与与负负电电荷荷的的数数目目正正好好相相等等，即即净净电电荷荷为为零零，则称该则称该 pH pH 值为该氨基酸的值为该氨基酸的等电点等电点 (pI) (pI)。 各种氨基酸都有其特定的等电点。各种氨基酸都有其特定的等电点。中性氨基酸的中性氨基酸的pIpI在微酸性；碱性氨基在微酸性；碱性氨基酸的酸的pIpI在碱性在碱性pHpH范围；酸性氨基酸的范围；酸性氨基酸的pIpI在酸性在酸性pHpH范围。范围。 氨基酸在等电点时溶解度最氨基酸在等电点时溶解度最小，易发生沉淀。工业上利用这一性小，易发生沉淀。工业上利用这一性质提取氨基酸。质提取氨基酸。 pH pI, pH pI, pH pI, 样品带样品带负电荷负电荷，样品点向，样品点向阳阳极移极移动动pH = pI, pH = pI, 样品样品不带电荷不带电荷，样品点，样品点不移动不移动寐枯烷岗弥魄惺护矽舍血酥箍蝎巳瀑萍朔帛锻羞艇毒闸挞当掇呐薯狼蜘驭蛋白质一级结构蛋白质一级结构氨基酸等电点的确定氨基酸等电点的确定（1）中性氨基酸中性氨基酸等电点（等电点（pIpI）的高低与氨基酸分子两性解）的高低与氨基酸分子两性解离基团的解离平衡常数有一定关系。用离基团的解离平衡常数有一定关系。用K1、K2分别表示分别表示-COOH-COOH和和-NH-NH3 3+ +表观解离平表观解离平衡常数时，它们的负对数分别用衡常数时，它们的负对数分别用pK1、pK2表示，则中性氨基酸的等电点在数值表示，则中性氨基酸的等电点在数值上等于两个上等于两个pK值之和的二分之一。即：值之和的二分之一。即： pI=(pK1+pK2)/2苞矣韦仲伟影聚厉侩苦荒刘渭枪丸你芜驳虑亨惨馈厦哎佬北朔屋柠翁骡摇蛋白质一级结构蛋白质一级结构2.2.酸、碱性氨基酸酸、碱性氨基酸在溶液中氨基酸随在溶液中氨基酸随pHpH升高而逐级解离升高而逐级解离时，总是时，总是pKpK值小的基团先解离，值小的基团先解离，pKpK值大者后解离。因此，对于具有三值大者后解离。因此，对于具有三个解离基团的氨基酸，只有靠近等电个解离基团的氨基酸，只有靠近等电离子的两个离子的两个pKpK值影响等电离子的浓值影响等电离子的浓度。所以，只要正确写出解离反应式，度。所以，只要正确写出解离反应式，皆可根据等电离子两边的皆可根据等电离子两边的pKpK计算其计算其pIpI值。值。酸性氨基酸：pI = (pK1 1 + pKR-COO- )/2 硷性氨基酸：pI = (pK2 2 + pKR-NH2 )/2 时楞撇曼配乳稚雌挥曳涂把尤讼呻嘎势劫志玫宝牲叁拴衙拂衍焕鄂协名芥蛋白质一级结构蛋白质一级结构（三）氨基酸的重要化学反应1.1.与亚硝酸反应与亚硝酸反应反应特点：反应特点：v（1 1）脯氨酸不发生该反应；）脯氨酸不发生该反应；v（2 2）只有）只有 氨基氮可发生此氨基氮可发生此反应，反应，R R上的氮几乎不参与反应。上的氮几乎不参与反应。v（3 3）通过测定）通过测定N N2 2 的体积（摩尔的体积（摩尔数），可测定游离氨基氮。数），可测定游离氨基氮。暮凑逞蔓避粪摔吁唾屎燃模储力穆桐条昧蝇翱远哟邻森蚌眶姬荡唯璃称骡蛋白质一级结构蛋白质一级结构2.2.与甲醛反应与甲醛反应反应特点：反应特点：反应放出反应放出H H+ + ，可用标准，可用标准NaOHNaOH溶液滴溶液滴定，是常用的测定氨基酸的反应。定，是常用的测定氨基酸的反应。元株圃佰抢灸澜茄窘操逐陷魏庆所寡尾祭神扑予稽惕咸明涕今艇季奔执蛰蛋白质一级结构蛋白质一级结构3.3.脱羧反应脱羧反应反应特点：反应特点：在专一性酶的催化下进行，放出在专一性酶的催化下进行，放出COCO2 2 , ,工业上通过呼吸仪测定工业上通过呼吸仪测定COCO2 2的量来的量来测定测定AAAA。仇榷肮倚唾坛彭政矛艰雇扶路袄鸦免修域墩路泊辨兑南兢叙硬磊殊翔挂适蛋白质一级结构蛋白质一级结构4.4.成盐反应成盐反应氨基和羧基分别可与酸和碱成盐。氨基和羧基分别可与酸和碱成盐。础眶炸痒狮耍潦西萄蛛螺熊够诽镶仔刨券弟平铬讽门抖振变企滋告兽幽迭蛋白质一级结构蛋白质一级结构5.5.成肽反应成肽反应一个氨基酸的一个氨基酸的 氨基和另一个氨氨基和另一个氨基酸基酸 羧基脱水缩合，生成的酰羧基脱水缩合，生成的酰胺叫做肽，这种酰胺键叫做胺叫做肽，这种酰胺键叫做肽键肽键。肽键的平面特征肽键的平面特征肽结构肽结构嘲蔑奄烯诌侵漫娥贷镍珊洲拳涨嘱李未涂永懒雏熙磺暗琼坯掖巾凤糕拭搐蛋白质一级结构蛋白质一级结构6.6.茚三酮反应（鉴别反应）茚三酮反应（鉴别反应）在450nm处有最大吸收率，在0.550 g / ml范围内，氨基酸含量与光密度成正比。硅泄猴骤瓢裔莽镜村携拘终遇郸点算焰室氰骤谊锯据辑漫区汽舒细柯挑神蛋白质一级结构蛋白质一级结构7.7.羰氨反应羰氨反应： 氨基酸的氨基与糖类的羰基氨基酸的氨基与糖类的羰基易发生反应，生成羰氨化合物，进而易发生反应，生成羰氨化合物，进而缩合成更复杂的棕色到黑色化合物缩合成更复杂的棕色到黑色化合物“类黑色素类黑色素”。食品加工中将这种反应。食品加工中将这种反应称为褐变。轻度的褐变可赋予食品一称为褐变。轻度的褐变可赋予食品一定的色、香、昧。但生成的黑色素则定的色、香、昧。但生成的黑色素则不能被细胞利用，也不能被发酵，不不能被细胞利用，也不能被发酵，不仅影响原料利用率，而且有毒副作用。仅影响原料利用率，而且有毒副作用。8.8.个别个别R R基团的反应（略）基团的反应（略）庐谚鲤攘夕甲倒阜渠黔磋扼馋土抠阐迪复险疼糠迪施怯杯毋恍豌做讼春植蛋白质一级结构蛋白质一级结构从蛋白质水解液中分离制备氨基酸或从蛋白质水解液中分离制备氨基酸或者分离分析氨基酸组成，需要分辩力者分离分析氨基酸组成，需要分辩力很强的分离技术。很强的分离技术。层析层析法是近代生化法是近代生化中非常有效的常用分离方法。对于氨中非常有效的常用分离方法。对于氨基酸混合样品，或者其他各种性质相基酸混合样品，或者其他各种性质相近，一般化学方法难以分离的混合样近，一般化学方法难以分离的混合样品，如核苷酸、糖类、蛋白质、维生品，如核苷酸、糖类、蛋白质、维生素、抗生素、激素。等等，都能使用素、抗生素、激素。等等，都能使用层析法达到分离分析的目的。层析法达到分离分析的目的。袄赁炳沥狐误冗裹汲几蚜受窝革叶毛畸镁戍氓隋量勿晨湾辐帚睫熟右馅伐蛋白质一级结构蛋白质一级结构层析分离是利用混合物中各组分的层析分离是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子形状和大小、物理化学性质（分子形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一个不同程度分布在两相中，其中一个是固定相，另一个是流动相，当流是固定相，另一个是流动相，当流动相流过固定相时，各组分以不同动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的方法。的速度移动，而达到分离的方法。层析技术的三个基本构成条件层析技术的三个基本构成条件v水不溶性惰性支持物。水不溶性惰性支持物。v流动相（能携带溶质沿支持物流动）。流动相（能携带溶质沿支持物流动）。v固定相（附着在支持物上，能对各种固定相（附着在支持物上，能对各种溶质的流动产生不同的阻滞作用）。溶质的流动产生不同的阻滞作用）。幂容饿寄斯偏岳喻栗抄敝抵蕊神阐骇排勋故额漓光斗屠喳大磨蚌膜崩核兼蛋白质一级结构蛋白质一级结构层析技术的分类层析技术的分类v按流动相的状态分按流动相的状态分：液相层析（液：液相层析（液相色谱）、气相层析（气相色谱）。相色谱）、气相层析（气相色谱）。v按固定相的使用形式分类按固定相的使用形式分类：柱层析、：柱层析、纸层析、薄层层析、薄膜层析。纸层析、薄层层析、薄膜层析。v按分离过程依据的理化性质分类按分离过程依据的理化性质分类：吸附层析、分配层析、离子交换层析、吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子筛过滤层析、亲和层析。分子筛过滤层析、亲和层析。层析技术的应用层析技术的应用对于分子大小不等的化台物，例如含多对于分子大小不等的化台物，例如含多种蛋白质的混合液，宜用分子筛过滤分种蛋白质的混合液，宜用分子筛过滤分离；对于能溶于有机溶剂，难溶于水的离；对于能溶于有机溶剂，难溶于水的化食物，常用吸附层析法分离；对于既化食物，常用吸附层析法分离；对于既溶于水也溶于有机溶剂的化合物，宜用溶于水也溶于有机溶剂的化合物，宜用分配层析分离；电解质混合物则宜用离分配层析分离；电解质混合物则宜用离交层析分离。交层析分离。滋埔描庶秃头绞琅尘诈遗菩岿却李弃孟诉实询画蹈艰痞容国牡于乍翟堤器蛋白质一级结构蛋白质一级结构分配层析技术分配层析技术分配层析是利用各组分的分配系数不分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法同而予以分离的方法。包括纸上层析、。包括纸上层析、薄层层析、气相层析。薄层层析、气相层析。分配系数是指一种溶质在两种互不相分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂的浓度比值。在两相溶剂的浓度比值。在层析条件在层析条件确定后，分配系数是一个常数。以确定后，分配系数是一个常数。以K K表表示。示。碎宛顽舔玛襄菇粉菊情勤梁醛唾臣帮频圃颁简彰面喇拒友坟译建酵罐鲍媳蛋白质一级结构蛋白质一级结构分配层析的基本原理分配层析的基本原理分配层析中，通常采用一种多孔性固分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅胶、纤维素粉、体支持物（如滤纸、硅胶、纤维素粉、淀粉、硅藻等）吸附着一种溶剂作为淀粉、硅藻等）吸附着一种溶剂作为固定相固定相，这种溶剂在层析过程中始终，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可以沿固定可以沿固定相流动相流动，即流动相。溶质，即流动相。溶质在流动相的带动下流经固定相时，溶在流动相的带动下流经固定相时，溶质在两相之间连续动态分配。由于不质在两相之间连续动态分配。由于不同溶质的分配系数不同而分离。同溶质的分配系数不同而分离。嘻叮洼绒瑰训碘彝泰陶慈株油冈棉杨墙炙拙臃砸蒋宅州辱狰慷擦澳岛力顿蛋白质一级结构蛋白质一级结构纸上层析纸上层析 纸上层析是以滤纸为支持物纸上层析是以滤纸为支持物的一种分配层析。滤纸能吸收的一种分配层析。滤纸能吸收22222525的水，其中的水，其中6 67 7的水以氢键的水以氢键与滤纸纤维上的羟基结合，难以脱去。与滤纸纤维上的羟基结合，难以脱去。所以所以纸上层析是以滤纸纤维的结合水纸上层析是以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂为流动相的层为固定相，以有机溶剂为流动相的层析技术析技术。由于各物质的分配系数不同，。由于各物质的分配系数不同，移动的速率也就不同，从而达到分离移动的速率也就不同，从而达到分离的目的。的目的。英深推门肝韶踌验恼藻迢谅观邻汾旭炬壶矛缘辉亡峭捍拍误瞪狱腔仟烛坟蛋白质一级结构蛋白质一级结构纸层析的纸层析的R Rf f值值溶质在滤纸上移动的速率用溶质在滤纸上移动的速率用R Rf f值表示：值表示：R Rf f值决定于被分离物质在两相间的分值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比，在同一配系数以及两相间的体积比，在同一实验条件下，两相的体积比是一个常实验条件下，两相的体积比是一个常数。所以数。所以R Rf f值决定于分配系数。不同值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同，物质的分配系数不同，R Rf f值也不同，值也不同，由此可以根据由此可以根据R Rf f值的大小对物质进行值的大小对物质进行定性分析。定性分析。孰咐碰黄摄卤酚舞痉差银贴壹酱彭呵井闺壶受陈股走膝念豌厦玩郴赂僻绎蛋白质一级结构蛋白质一级结构纸层析的操作纸层析的操作 1. 1.样品处理样品处理 2. 2.点样点样 3. 3.平衡平衡 4. 4.展展开开 5. 5.显显色色 6. 6.定性分定性分析析 7. 7.定量分定量分析析尽可能纯化，调节尽可能纯化，调节pHpH、浓度、浓度。将样品溶液用微量注射器点在原点。将样品溶液用微量注射器点在原点。在密闭层析缸内用溶液系统的蒸汽将在密闭层析缸内用溶液系统的蒸汽将滤纸饱和。滤纸饱和。将滤纸的一端浸入溶剂中，让其沿滤将滤纸的一端浸入溶剂中，让其沿滤纸移动。纸移动。为了看清斑点，用显色剂显色。为了看清斑点，用显色剂显色。计算计算R Rf f值，进行定性。值，进行定性。剪洗比色、直接比色、剪洗比色、直接比色、面积测量。面积测量。沥肖箭纳巧绦嘶职眉蒜舱三牢厅氯玻闷佐予鸵季得啥彪冀喂堪误鲤身河庄蛋白质一级结构蛋白质一级结构离子交换柱层析离子交换柱层析离子交换柱层析是用离子交换柱层析是用离子交换剂作离子交换剂作为水不溶性支持物兼固定相为水不溶性支持物兼固定相, ,装成层装成层析柱，用析柱，用不同不同pHpH和不同离子强度的和不同离子强度的缓冲液作流动相缓冲液作流动相( (洗脱液洗脱液) )构成的柱构成的柱层析技术。这是目前应用非常普遍层析技术。这是目前应用非常普遍的分离技术，无论实验室还是生产的分离技术，无论实验室还是生产领域都有广泛的实用性。领域都有广泛的实用性。锯凹唬绘虐跨粮奖瘤莎薯煽涩模带宏禁谤哥募阿痰希涟奶韭宇迷册拾墓融蛋白质一级结构蛋白质一级结构离子交换剂离子交换剂是含有若干活性基团的不是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。即在不溶性母体上溶性高分子物质。即在不溶性母体上引入若干可解离基团。引入若干可解离基团。不溶性母体不溶性母体：苯乙烯树脂、酚醛树脂、：苯乙烯树脂、酚醛树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。引入的活性基团，可以是酸性基团，引入的活性基团，可以是酸性基团，也可以是碱性基团。也可以是碱性基团。在不溶性母体上引入酸性基团，如磺在不溶性母体上引入酸性基团，如磺酸基（酸基（-SO-SO3 3 H H）、磷酸基（）、磷酸基（-PO3H2-PO3H2）、）、亚磷酸基（亚磷酸基（- PO2H- PO2H）、羧基（）、羧基（- -COOHCOOH）等时，可解离出）等时，可解离出H H+ + ，与其它阳，与其它阳离子交换，这种离子交换树脂属于阳离子交换，这种离子交换树脂属于阳离子交换树脂。离子交换树脂。在不溶性母体上引入碱性基团，如季在不溶性母体上引入碱性基团，如季胺胺-N-N+ +（CHCH3 3）3 3 、叔胺、叔胺-N-N（CHCH3 3）2 2 、仲胺、仲胺-NHCH-NHCH3 3 、伯胺、伯胺- -NHNH2 2等含氨基的基团，可与等含氨基的基团，可与OHOH- -结合后，结合后，与其它阴离子交换，属于阴离子交换与其它阴离子交换，属于阴离子交换树脂。树脂。再捞号轴柯缔成炮肆倪契友滤右陈乡开疾三袁尼钟损论顶冒望薄条阻萌钎蛋白质一级结构蛋白质一级结构分配系数（平衡常数）分配系数（平衡常数）在一定条件下，离子交换剂所吸附离在一定条件下，离子交换剂所吸附离子浓度和在溶液中的离子浓度达到平子浓度和在溶液中的离子浓度达到平衡时，两者浓度之比叫做衡时，两者浓度之比叫做分配系数分配系数（也叫（也叫平衡常数平衡常数）即：）即：K K值的大小决定样品离子在柱内的保值的大小决定样品离子在柱内的保留时间。如果样品中各离子的留时间。如果样品中各离子的K K值差值差别足够大，这些离子通过离子交换层别足够大，这些离子通过离子交换层析就可以得到分离。析就可以得到分离。阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阴阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阴离子只能被阴离子交换剂吸附；亲和离子只能被阴离子交换剂吸附；亲和力大的易吸附，难洗脱；亲和力小的力大的易吸附，难洗脱；亲和力小的难吸附，易洗脱。难吸附，易洗脱。婆湖戳邹僚遏彰眼赘茎亿笆簿娩撰扫橱纸翘捻搽吐邪怖裁卸灿耳宽枕液司蛋白质一级结构蛋白质一级结构氨基酸的离子交换层析分离氨基酸的离子交换层析分离当使用阳离子交换树脂柱时，在当使用阳离子交换树脂柱时，在pH23pH23的条件下，各种氨基酸都带正的条件下，各种氨基酸都带正电荷，都能交换，上柱。与树脂的静电荷，都能交换，上柱。与树脂的静电亲和力大小依次为：碱性氨基酸电亲和力大小依次为：碱性氨基酸（A A2+2+）中性氨基酸）中性氨基酸(A(A+ +) )酸性氨基酸性氨基酸酸(A(A) )。当用缓冲液洗脱时，随当用缓冲液洗脱时，随pHpH由低到高，由低到高，氨基酸洗脱流出的次序大体上是酸性氨基酸洗脱流出的次序大体上是酸性氨基酸先流出，其次是中性氨基酸，氨基酸先流出，其次是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。最后是碱性氨基酸。同种性质的氨基同种性质的氨基酸，酸，R R基团与树脂间亲和力小者先流出，基团与树脂间亲和力小者先流出，大者后流出。大者后流出。围息酪庇握拽愚婶巩售记痹汀躁拟株慈擎茎赵胶孪弄充伐沏颧傲狈黄雀哀蛋白质一级结构蛋白质一级结构离子交换层析技术的自动化离子交换层析技术的自动化返回鹊炙掺某斧护沼拜猿峭蹈钉栏汰斡摘浩涌帝始琶眯消老管虑视章铲表放吝蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质分子是蛋出质的具有完整生蛋白质分子是蛋出质的具有完整生物功能的最小结构单位。物功能的最小结构单位。19521952年丹麦人年丹麦人Linderstrom-LangLinderstrom-Lang最早最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次提出蛋白质的结构可以分成四个层次: :v一级结构一级结构：氨基酸序列氨基酸序列v二级结构：二级结构：-螺旋，螺旋，-折叠折叠v三级结构：三级结构：所有原子空间位置所有原子空间位置v 四级结构：四级结构：蛋白质多聚体蛋白质多聚体恫嫌梳募沤臻屋顾训迎惨铃掠撼丘串疹节夫言当衣前侨俗贮眉容庭倡辆提蛋白质一级结构蛋白质一级结构 一级结构又叫初级结构、基一级结构又叫初级结构、基本化学结构或共价结构。本化学结构或共价结构。19691969年国际年国际纯粹与应用化学联合会纯粹与应用化学联合会(IUPAC)(IUPAC)定义定义为：一级结构即肽链中的氨基酸顺序。为：一级结构即肽链中的氨基酸顺序。 一级结构是高级结构的化学基础，一级结构是高级结构的化学基础，也是认识蛋白质分子生物功能、结构也是认识蛋白质分子生物功能、结构与生物进化的关系、结构变异与分子与生物进化的关系、结构变异与分子病的关系等许多复杂问题的重要基础。病的关系等许多复杂问题的重要基础。研究一级结构需要阐明的内容包括：研究一级结构需要阐明的内容包括：q（1 1）蛋白质分子的多肽链数目。）蛋白质分子的多肽链数目。q（2 2）每条肽链的末端残基种类。）每条肽链的末端残基种类。q（3 3）每条肽链的氨基酸顺序。）每条肽链的氨基酸顺序。q（4 4）链内或链间二硫键的配置等。）链内或链间二硫键的配置等。 缝痒架狐玖棒施到诊蘑迎奢光耶襄错貌蛾洁揣件券汇宗蚤焚朽效恫粟维忿蛋白质一级结构蛋白质一级结构多肽链多肽链 氨基酸通过肽键连接起来的链状氨基酸通过肽键连接起来的链状物根据其长短称为寡肽、短肽、多肽物根据其长短称为寡肽、短肽、多肽和蛋白质，很多场合多肽和蛋白质可和蛋白质，很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。以等同使用。 研究蛋白质的研究蛋白质的一级结构一级结构，就是要，就是要将氨基酸的排列顺序搞清楚。将氨基酸的排列顺序搞清楚。 四十年代起，许多人不遗余力四十年代起，许多人不遗余力从事蛋白质的一级结构研究。从事蛋白质的一级结构研究。一级结构研究史上的两个第一一级结构研究史上的两个第一19541954年英国生化学家年英国生化学家SangerSanger报道了报道了胰岛素的一级结构，是世界上第一例胰岛素的一级结构，是世界上第一例确定一级结构的蛋白质。确定一级结构的蛋白质。SangerSanger由此由此19581958年获年获Nobel Nobel 化学奖。化学奖。19651965年我国科学家完成了结晶牛胰年我国科学家完成了结晶牛胰岛素的合成，是世界上第一例人工合岛素的合成，是世界上第一例人工合成蛋白质。成蛋白质。赋劳章止淌挑盼狙潭耿叛半卡犬孜疾喧诈谎陶婿用主培胁右颖淬粉绸晚坏蛋白质一级结构蛋白质一级结构多肽链的结构多肽链的结构狄匙坪复倪杠绍烟霹茧汝卉叶脏榴妖蛇顾邀丛轴岸痔苍羡茧梦攘故屠居相蛋白质一级结构蛋白质一级结构一级结构中的二硫键一级结构中的二硫键训包磕茸验痒围逝堵屿扭卯掺盖龟啡岳挎漏度板咒枢钳瘟盯庶奠婉孕洞渐蛋白质一级结构蛋白质一级结构分析一级结构的一般程序分析一级结构的一般程序 一级结构的分析是一项非常细致一级结构的分析是一项非常细致而又复杂的技术上作，基本工作程序而又复杂的技术上作，基本工作程序是：是：（1 1）将蛋白质纯化，测定末端组成。）将蛋白质纯化，测定末端组成。（2 2）拆分蛋白质分于并将多肽分离）拆分蛋白质分于并将多肽分离纯化。纯化。（3 3）用酶法或化学方法进行专一性）用酶法或化学方法进行专一性切割，得到系列长短不一的肽段。切割，得到系列长短不一的肽段。（4 4）将肽段分离，通过末端分析方）将肽段分离，通过末端分析方法测定各肽段的氨基酸顺序。法测定各肽段的氨基酸顺序。（5 5）根据二肽段的顺序重叠关系确）根据二肽段的顺序重叠关系确定各个肽段的衔接顺序。排出完整定各个肽段的衔接顺序。排出完整多肽链的氨基酸顺序。多肽链的氨基酸顺序。（6 6）确定二硫键的位置。）确定二硫键的位置。SangerSanger试剂试剂(FDNB)(FDNB)标记标记N N末端末端ABCDE*ABCDE*A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE*A,*A+B, *A+B+C+D+E*A,*A+*B, *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 结论结论：A B C D E乔吧锁渊竿享抽门鸡甚缺硒缸摆忿弘况捣十嘛廓胁肪望狙珐扑寥扫公越釉蛋白质一级结构蛋白质一级结构一级结构与蛋白质功能的关系一级结构与蛋白质功能的关系一级结构中，有的部位保守性很强，一级结构中，有的部位保守性很强，既不能缺失，也不能更换，否则就既不能缺失，也不能更换，否则就会丧失活性；有的部位则可以改变，会丧失活性；有的部位则可以改变，切除或更换别的残基都不影响生物切除或更换别的残基都不影响生物活件；还有的部位必须切除之后，活件；还有的部位必须切除之后，蛋白质分子才显活性。不同部位的蛋白质分子才显活性。不同部位的残基对功能的影响，实质是影响了残基对功能的影响，实质是影响了蛋白质分子特定的空间构象的形成。蛋白质分子特定的空间构象的形成。许多先天性疾病是由于某一重要的许多先天性疾病是由于某一重要的蛋白质的一级结构发生了差错引起蛋白质的一级结构发生了差错引起的。如血红蛋白的。如血红蛋白亚基亚基6 6 位位GluGlu被被ValVal代替（基因突变），即表现为代替（基因突变），即表现为镰刀状贫血，为世上最常见的血红镰刀状贫血，为世上最常见的血红蛋白病。蛋白病。比较不同生物细胞色素比较不同生物细胞色素C C的一级结的一级结构可以帮助了解物种间的进化关构可以帮助了解物种间的进化关系，物种间越接近，则细胞色素系，物种间越接近，则细胞色素C C的一级结构越相似的一级结构越相似牛胰岛素分子的激活：牛胰岛素分子的激活：浮涟筛桶琼滦矩昔姚恨掳锅落茸悦垣饭直诱吉希蔫佐播嚼候卜偿涡索僧憾蛋白质一级结构蛋白质一级结构天然活性肽天然活性肽 除了蛋白质水解可以产生长短不除了蛋白质水解可以产生长短不等的肽段之外，生物体内还有很多游等的肽段之外，生物体内还有很多游离存在的小分子活性肽，各具有一定离存在的小分子活性肽，各具有一定的生物功能。有些活性肽属于激素类，的生物功能。有些活性肽属于激素类，如催产素、加压素等都是九肽。如催产素、加压素等都是九肽。返回勇吉戎凹童沂释找收鹤触产恩滥仪螺魏役生凌见吊枯拷瓢憨舆瘩宦这盾量蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的空间结构蛋白质的空间结构所谓蛋白质分子的空间结构是指分子的所谓蛋白质分子的空间结构是指分子的构构象象而言。构象与构型都是立体化学结构概而言。构象与构型都是立体化学结构概念，但含义不同。念，但含义不同。构型是由于化合物分子构型是由于化合物分子中某一不对称碳原子上四种不同的取代基中某一不对称碳原子上四种不同的取代基团（或原子）的空间排列所形成的一种光团（或原子）的空间排列所形成的一种光学活性立体结构。学活性立体结构。一个不对称碳原子只能一个不对称碳原子只能形成两种不同的构型。分子从一种构型变形成两种不同的构型。分子从一种构型变为另一种构型，例如从为另一种构型，例如从D-D-丙氨酸变为丙氨酸变为L-L-丙丙氨酸，必须发生共价键的变化（断裂和另氨酸，必须发生共价键的变化（断裂和另生成）。生成）。 构象是分子内所有原子或原子团的空间排构象是分子内所有原子或原子团的空间排布所形成的布所形成的种立体结构。种立体结构。这类立体结构这类立体结构不需要共价键断开，只要分产中发生不需要共价键断开，只要分产中发生C CC C单键的转动就能从一种构象变为另单键的转动就能从一种构象变为另种构种构象。如此说来，蛋白质分子该有无数构象象。如此说来，蛋白质分子该有无数构象了，其实不然。研究证明，天然蛋白质分了，其实不然。研究证明，天然蛋白质分子都有与其生物活性相关的一种或少数几子都有与其生物活性相关的一种或少数几种特定的构象，这种天然构象相当稳定。种特定的构象，这种天然构象相当稳定。定条件下，将蛋白质分子从细胞中分离定条件下，将蛋白质分子从细胞中分离出来，仍能保持其天然构象和生物活性。出来，仍能保持其天然构象和生物活性。痰誓瓤糟聪寒园且奴嗅堵酮丁胶版轻澎钒住硕河制傈窄锨鼎墟读轮冠踪四蛋白质一级结构蛋白质一级结构维系蛋白质分子构象的化学键维系蛋白质分子构象的化学键宰泉秩乓镭邻苛吮渤泌怯异神饲熄管邑妙攫睹逸啥颊脂谣澎掸厦天芦铜土蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构二级结构：二级结构：多肽链中各原子在局部空多肽链中各原子在局部空间或一段肽链的氨基酸残基的空间排间或一段肽链的氨基酸残基的空间排布方式。布方式。为主链构象，不涉及侧链构为主链构象，不涉及侧链构象。包括象。包括-螺旋、螺旋、 - -折叠以及折叠以及-转转角，角，这些主链基本构象都是以酰胺平这些主链基本构象都是以酰胺平面（或称肽键平面、肽单元）为基本面（或称肽键平面、肽单元）为基本结构单位，有规则的盘曲而成的。也结构单位，有规则的盘曲而成的。也存在部分无规则卷曲。存在部分无规则卷曲。肽键平面肽键平面肽键平面肽键平面肽链中的肽键平面肽链中的肽键平面两个肽平面以两个肽平面以一个一个C C为中心为中心发生旋转发生旋转倦戊殷械爆矽榆猫灾佩派藐犀粗骏慑约友携湖箍危捡篓寂赴恰绪键板畏妖蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质蛋白质-螺旋结构螺旋结构右手螺旋右手螺旋( (顺时针顺时针) )。肽链的主链形成紧密的螺旋肽链的主链形成紧密的螺旋, ,侧链伸侧链伸向外侧，每一圈包含向外侧，每一圈包含3.63.6个氨基酸残个氨基酸残基基, ,每个残基跨距为每个残基跨距为0.15nm,0.15nm,螺旋上升螺旋上升一圈的距离一圈的距离( (螺距螺距) )为为3.60.15=0.54nm3.60.15=0.54nm，环内原子数，环内原子数1313。螺旋通过氢键维持稳定。第一个肽螺旋通过氢键维持稳定。第一个肽键的键的NHNH和第四个肽键的和第四个肽键的COCO形成氢键形成氢键, ,第第n n个肽键的个肽键的NHNH和第和第n+3n+3个肽键的个肽键的COCO形形成氢键。氢键取向与主轴基本平行。成氢键。氢键取向与主轴基本平行。-螺旋结构形成的限制因素螺旋结构形成的限制因素凡是有凡是有ProPro存在的地方存在的地方, ,不能形成。因不能形成。因ProPro形成的肽键形成的肽键N N原子上没有原子上没有H,H,不能形成氢键。不能形成氢键。静电斥力。若一段肽链有多个静电斥力。若一段肽链有多个GluGlu或或AspAsp相邻相邻, ,则因则因pH=7.0pH=7.0时都带负电荷时都带负电荷, ,防碍防碍螺螺旋的形成旋的形成; ;同样多个碱性氨基酸残基在一段同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内肽段内, ,正电荷相斥正电荷相斥, ,也防碍也防碍螺旋的形成。螺旋的形成。位阻。如位阻。如AsnAsn、LeuLeu侧链很大，防碍侧链很大，防碍螺螺旋的形成。旋的形成。芒壁吸荤辉贸侍馒胜过盐吊名割涤埂藐沤序搅此窑内厚魔插醉怠耶惦问辱蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质蛋白质折叠折叠结构结构-折迭又叫折迭又叫-折迭片或折迭片或-片层结构，片层结构，也是蛋白质分子中常见的主链构象之也是蛋白质分子中常见的主链构象之一。所谓一。所谓-折迭是两条或两条以上充折迭是两条或两条以上充分伸展成锯齿状折迭构象的肤链侧向分伸展成锯齿状折迭构象的肤链侧向聚集，按肽链的长轴方向平行并列，聚集，按肽链的长轴方向平行并列，形成的折扇状构象。形成的折扇状构象。-折迭构象靠相折迭构象靠相邻肽链主链亚氨基（邻肽链主链亚氨基（NHNH）和羰基氧原）和羰基氧原子之间形成有规律的氢键联结维系。子之间形成有规律的氢键联结维系。平行式平行式N端端N端端平行式与反平行式平行式与反平行式嘉挑园措条优全框搪姬滦佰捎拎陀沁勋踏用樟只蔼卒胯喂睬从活漏古褪舶蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的蛋白质的-转角结构转角结构又叫又叫U U型回折、型回折、-转弯或发夹结构。转弯或发夹结构。是近年来在球状蛋白质分子中发现的是近年来在球状蛋白质分子中发现的一种主链构象。球状蛋白质分子主链一种主链构象。球状蛋白质分子主链在盘曲折迭运行中往往发生在盘曲折迭运行中往往发生180180的急的急转弯，这种回折部位的构象即所谓转弯，这种回折部位的构象即所谓-转角。转角。-转角是由转角是由4 4个连续的残基组个连续的残基组成的，第一个残基的羰基与第四个残成的，第一个残基的羰基与第四个残基的亚氨基间形成氢键联结，稳定构基的亚氨基间形成氢键联结，稳定构象。象。嫉判坷卓例床闽审颠酝卤沤恤旗丛妊柜祥阁旧诲篆阔秸撩龚抛谁识诵伪贵蛋白质一级结构蛋白质一级结构二级结构的多元性二级结构的多元性球状蛋白质分子的二级结构一般都不球状蛋白质分子的二级结构一般都不是单一构象。主链的不同段落构象不是单一构象。主链的不同段落构象不同，多种构象单元交替连接组成整条同，多种构象单元交替连接组成整条肽链的二级构象。肽链的二级构象。控舟大屎煌锋菲鱼啤剧家宗哆除否湿毛物朵林帖夕葵蘸烬骤形岂冉绿相呈蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构 蛋白质分子在一、二级结构蛋白质分子在一、二级结构基础上，再进行三维空间的多向性盘基础上，再进行三维空间的多向性盘曲折迭。形成特定的近似球状的构象，曲折迭。形成特定的近似球状的构象，称为步白质分子的三级结构。根据称为步白质分子的三级结构。根据l l 969969年年IUPACIUPAC的定义，三级结构包括蛋的定义，三级结构包括蛋白质分子主链和侧链所有原子或原子白质分子主链和侧链所有原子或原子团的空间排布关系。团的空间排布关系。蛋白质三级结构的构象特点蛋白质三级结构的构象特点（1 1）三级结构构象近似球形。）三级结构构象近似球形。 （2 2）分子中的亲水基团相对集中在球形）分子中的亲水基团相对集中在球形分子的表面，疏水基团相对集中在分子内分子的表面，疏水基团相对集中在分子内部，形成所谓部，形成所谓“亲水表面，疏水核亲水表面，疏水核”。（3 3）三级结构构象的稳定性主要靠疏水）三级结构构象的稳定性主要靠疏水相互作用维系。亲水表面能吸附形成厚厚相互作用维系。亲水表面能吸附形成厚厚的水化膜和双电层，对蛋出质分子构象起的水化膜和双电层，对蛋出质分子构象起很好的保护作用。很好的保护作用。（4 4）三级结构形成之后，蛋白质分子的）三级结构形成之后，蛋白质分子的生物活性部位就形成了。生物活性部位就形成了。些恭搔骑齐绷网捍添沙怎弧砌桂糊悉恿辜腆杉连筏碌脆惫忘斌坯蟹腻雁谱蛋白质一级结构蛋白质一级结构结构域结构域 有些较大的球状蛋白质分子有些较大的球状蛋白质分子或亚基，常常先由几个二级结构单元或亚基，常常先由几个二级结构单元组合在一起形成超二级结构，以此作组合在一起形成超二级结构，以此作为形成三级结构的实体，这些超二级为形成三级结构的实体，这些超二级结构实体称为结构域，又叫辖区。结结构实体称为结构域，又叫辖区。结构域进一步缔合则形成近似球形的三构域进一步缔合则形成近似球形的三级结构。级结构。剥虑它蔑妨详烁评姓小鬼剥芯猛诀落欺碧吴爪西镶寸怪吮院灾匠资悄芒鹿蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构有些球状蛋白质分子是由两个或两个有些球状蛋白质分子是由两个或两个以上的三级结构单位缔合而织成的，以上的三级结构单位缔合而织成的，通常称为寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中通常称为寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中的每个三级结构单位称为一个亚基的每个三级结构单位称为一个亚基（或亚单位）。（或亚单位）。所谓蛋白质分子的四所谓蛋白质分子的四级结构就是指寡聚蛋白质分子中亚基级结构就是指寡聚蛋白质分子中亚基与亚基间的立体排布及相互作用关系，与亚基间的立体排布及相互作用关系，亚基的数目和类型也属四级结构研究亚基的数目和类型也属四级结构研究的内容，但不涉及亚基本身的构象。的内容，但不涉及亚基本身的构象。两个亚基的结构两个亚基的结构血红蛋白血红蛋白应龚俯仟晴箍熬应橱喜撞旋侯眉促歧掠啸寞截穷睡剑愤朴蛔负横悍信冉作蛋白质一级结构蛋白质一级结构寡聚蛋白质分子的亚基组成寡聚蛋白质分子的亚基组成 据统计，已经研究过的寡聚据统计，已经研究过的寡聚蛋白质分子达蛋白质分子达700700多种。它们的亚基多种。它们的亚基数目差别很大，少则几个，多则十几数目差别很大，少则几个，多则十几个，数十个。大多数寡聚蛋白质是由个，数十个。大多数寡聚蛋白质是由偶数亚基组成的。其中，两个或四个偶数亚基组成的。其中，两个或四个亚基者最多。奇数亚基的分子很少见。亚基者最多。奇数亚基的分子很少见。 亚基类别组成有两种类型。一亚基类别组成有两种类型。一种是由相同亚基组成的均一寡聚蛋白，种是由相同亚基组成的均一寡聚蛋白，如过氧化氢酶，是由四个相同亚其组成如过氧化氢酶，是由四个相同亚其组成的四聚体，每个亚基的一、二、三级结的四聚体，每个亚基的一、二、三级结构都相同，功能也相同。另一种是由结构都相同，功能也相同。另一种是由结构不同的亚基组成的非均构不同的亚基组成的非均寡聚蛋白，寡聚蛋白，如血红蛋白（如血红蛋白（2 22 2）。）。 维持四级结构稳定的因素为各亚基维持四级结构稳定的因素为各亚基之间的作用力如氢键、离子键、疏水键。之间的作用力如氢键、离子键、疏水键。 含有四级结构的蛋白质，单独的亚含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没有生物学功能，只有完整的四基一般没有生物学功能，只有完整的四级结构才有生物学功能。级结构才有生物学功能。肺彝灭砒拼潜棉矢伸讨箭疟画虾晋旨袖纂躲朵桌阿狮焚窃雾巧食肘访埠勤蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的一、二、三、四级结构蛋白质的一、二、三、四级结构菇鹃暑带绳曲孜某殖遂腐膛标犹捻叔闻蚊颓砧令坟忆杆贰莉脐扩躯汪蛰李蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质分子构象与功能的关系蛋白质分子构象与功能的关系蛋白质分子的构象并不是固定不变的。蛋白质分子的构象并不是固定不变的。许多蛋白质在表现其生物学功能时，许多蛋白质在表现其生物学功能时，构象发生变化，从而改变了整个分子构象发生变化，从而改变了整个分子的性质，这种现象称为的性质，这种现象称为变构现象变构现象。血。血红蛋白在表现其输氧功能时的变构现红蛋白在表现其输氧功能时的变构现象就是一个典型的例子。象就是一个典型的例子。1.1.血红蛋白的结构与功能的关系血红蛋白的结构与功能的关系 血红蛋白是由两个血红蛋白是由两个-亚基和两个亚基和两个-亚基组合而成的四聚体。血红蛋亚基组合而成的四聚体。血红蛋白的亚基中分子各有一个血红素，能白的亚基中分子各有一个血红素，能结合一分子结合一分子O O2 2 。血红蛋白的亚基之间。血红蛋白的亚基之间相互作用形成了稳定的四级结构，使相互作用形成了稳定的四级结构，使其中的血红素与其中的血红素与O O2 2的亲和力变得很弱。的亲和力变得很弱。当血红蛋白分子中一个亚基的血红素当血红蛋白分子中一个亚基的血红素与与O O2 2结合，立即引起该亚基的构象发结合，立即引起该亚基的构象发生改变，这种构象变化随即通过亚基生改变，这种构象变化随即通过亚基间的次级键引起另外间的次级键引起另外3 3个亚基的构象相个亚基的构象相继改变，结果改变了整个分子的构象，继改变，结果改变了整个分子的构象，使所有尚未与使所有尚未与O O2 2结合的亚基都变成适结合的亚基都变成适宜于与宜于与O O2 2结合的构象，从而使血红蛋结合的构象，从而使血红蛋白的氧合速度大大加快。白的氧合速度大大加快。O2HbHb- O2O2血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细血活动肌肉毛细血管中的管中的PO20 20 40 60 80 100肺泡中的肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin2.2.核糖核酸酶核糖核酸酶S S的空间结构与功能的关系的空间结构与功能的关系核糖核酸酶核糖核酸酶S S三维结构的形成与维系也三维结构的形成与维系也有赖于多肽链内部的有赖于多肽链内部的4 4个二硫键，个二硫键，6060年年代初，有人在含有巯基乙醇的代初，有人在含有巯基乙醇的8mol8molL L尿素溶液中还原二硫键，使核糖核酸酶尿素溶液中还原二硫键，使核糖核酸酶S S变性失活，然后透析除去尿素和巯基变性失活，然后透析除去尿素和巯基乙醇。乙醇。在含有氧和痕量巯基乙醇的水溶液中，在含有氧和痕量巯基乙醇的水溶液中，变性的核糖核酸酶变性的核糖核酸酶S S结构由伸展的肽链结构由伸展的肽链自动折叠，重新形成的二硫键配对完全自动折叠，重新形成的二硫键配对完全正确，酶活性几乎恢复到原有的水平。正确，酶活性几乎恢复到原有的水平。这个实验充分证明了蛋白质的功能取决这个实验充分证明了蛋白质的功能取决于其特定的天然构象，而规定其构象所于其特定的天然构象，而规定其构象所需要的信息包含在它的氨基酸序列之中。需要的信息包含在它的氨基酸序列之中。返回金纷铜掠壶九撰趴粕盒快洱邹伍摔徐柯骸跑苔膨禽粒赐榔夹亏烈瞬圈锯业蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的重要理化性质蛋白质的重要理化性质因为蛋白质是氨基酸组成的，所以，因为蛋白质是氨基酸组成的，所以，氨基酸的许多理化性质必然反映到蛋氨基酸的许多理化性质必然反映到蛋白质上。如两性解离和等电点、成酯白质上。如两性解离和等电点、成酯反应、成盐反应、一些显色反应、光反应、成盐反应、一些显色反应、光吸收性质等在蛋白质上都有所表现。吸收性质等在蛋白质上都有所表现。不仅如此，从氨基酸小分子到蛋白质不仅如此，从氨基酸小分子到蛋白质大分子已经发生了质的变化，所以，大分子已经发生了质的变化，所以，蛋白质又具有氨基酸所不具备的许多蛋白质又具有氨基酸所不具备的许多性质。性质。丛棕矣哮痛忠秆弃羌郊叹镣真悸鞭笋澳鹏蔽若扰习瞩急赊搂街秒葱态股鸳蛋白质一级结构蛋白质一级结构1.1.蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质是生物大分子，相对分子蛋白质是生物大分子，相对分子质量一般都在质量一般都在1 1100100万之间，其颗粒大小万之间，其颗粒大小属于胶体粒子的范围。属于胶体粒子的范围。蛋白质水溶液是一蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（水化层）；另外蛋白外面形成一层水膜（水化层）；另外蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚使蛋白质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。沉淀。莫念总元颂肆殴模拉棠粉乃渔斡舷什勉沈肯伏兔眶盈吼纵酞桃遇千指用疾蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用透析法透析法: :利用蛋白质不能透过半透膜利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（这种方法称为透析（dialysisdialysis）。）。舷翌容慎甄身冠其明弄险蔓墟嚎霹衬贝称簧沽标尔莹她亩吸械婪滨棒烤傀蛋白质一级结构蛋白质一级结构膜分离与超滤技术膜分离与超滤技术：透析是一种膜过滤透析是一种膜过滤技术，曾为生物大分子的分离纯化起过技术，曾为生物大分子的分离纯化起过重要作用。重要作用。7070年代以来随着合成滤膜年代以来随着合成滤膜的发展，膜过滤技术发展很快，其中，的发展，膜过滤技术发展很快，其中，超滤技术已经于蛋白质溶液的浓缩、纯超滤技术已经于蛋白质溶液的浓缩、纯化及分级分离。超滤是一种加压膜过滤化及分级分离。超滤是一种加压膜过滤技术，它是利用具有选择透过性的微孔技术，它是利用具有选择透过性的微孔滤膜，在液压作用下迫使小分子水和无滤膜，在液压作用下迫使小分子水和无机盐等透过膜，大分则被阻留在膜的内机盐等透过膜，大分则被阻留在膜的内侧，从而达到分离纯化的目的。侧，从而达到分离纯化的目的。 矢危寞隶顺病佬叉不芯帆祁像酒亮咒堪惠嫁侣袖卉肚岩押歇魔姓所惯希攘蛋白质一级结构蛋白质一级结构2.蛋白质的两性解离和等电点蛋白质的两性解离和等电点沽确溉榔刑乃养逝别漂尿缚芥帜领崎带宽胸记胰互泼丸猴声绿衙岛油陇症蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质等电点的应用蛋白质等电点的应用等电沉淀技术等电沉淀技术：在等电点：在等电点pHpH条件下，条件下，蛋白质为电中性，比较稳定。其物理蛋白质为电中性，比较稳定。其物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电沉淀技术。质的分离制备，被称为等电沉淀技术。电泳技术电泳技术：在溶液在溶液pHpH值不等于等电点值不等于等电点的条件下，蛋白质分子显电性，在直的条件下，蛋白质分子显电性，在直流电场中向其所带电荷相反的电极泳流电场中向其所带电荷相反的电极泳动。根据这一原理建立了将带电性质动。根据这一原理建立了将带电性质不同的蛋白质混合物，在直流电场中不同的蛋白质混合物，在直流电场中进行电泳分离的技术，称力蛋白电泳。进行电泳分离的技术，称力蛋白电泳。蛋白质电泳技术也是蛋白质分离制备、蛋白质电泳技术也是蛋白质分离制备、分析鉴定中常用的一种实验手段。分析鉴定中常用的一种实验手段。 渔决篷巧寞吉潜锡俺簇钝驾长擞甜疹潞殿邦谷撼澜跺销孽潞阅押楞邢顶袜蛋白质一级结构蛋白质一级结构3.蛋白质的变性作用蛋白质的变性作用在某些物理化学因素作用下，蛋白质在某些物理化学因素作用下，蛋白质分子内部的次级键断裂，二、三级空分子内部的次级键断裂，二、三级空间结构被破坏，分子的紧密构象变成间结构被破坏，分子的紧密构象变成了松散的无序状态。天然构象破坏，了松散的无序状态。天然构象破坏，从而引起理化性质改变，生物活性丧从而引起理化性质改变，生物活性丧失。叫做蛋白质的变性作用。失。叫做蛋白质的变性作用。注意注意：蛋白质变性后一级结构没有发：蛋白质变性后一级结构没有发生变化。只是空间构象发生变化。生变化。只是空间构象发生变化。造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外线、线、X X线等。线等。变性变性复性复性注意注意：并不是所有变性蛋白都可以复：并不是所有变性蛋白都可以复性的！性的！肝山谤直肘近浮妹瑰膘窟缨馏澜版勾骆赤澄罩栈级斌踩故菏摈辉侵赢胚抖蛋白质一级结构蛋白质一级结构变性蛋白质的性质变性蛋白质的性质v理化性质发生了变化，旋光性改变，理化性质发生了变化，旋光性改变，粘度增加，光吸收性质增，强失去了粘度增加，光吸收性质增，强失去了结晶能力，溶解度降低，易发生凝集、结晶能力，溶解度降低，易发生凝集、沉淀。由于侧链基团外露，颜色反应沉淀。由于侧链基团外露，颜色反应增强。增强。v生化性质发生了变化，变性蛋白质生化性质发生了变化，变性蛋白质比天然蛋白质易被蛋白酶水解。比天然蛋白质易被蛋白酶水解。 v生物活性丧失，这是蛋白质变性的生物活性丧失，这是蛋白质变性的最重要的明显标志之一。最重要的明显标志之一。镰锰造昏咸要具痹旋沧渺吩掠逞顷焙旦硝控纳段芍膊拂爬皆秦蛙柱澳惕盯蛋白质一级结构蛋白质一级结构4.4.蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、相对的。假若改变环境条件，件的、相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲水胶体使失去稳定性，发生絮结沉淀水胶体使失去稳定性，发生絮结沉淀现象。这即所谓蛋白质现象。这即所谓蛋白质沉淀作用沉淀作用。临趾迎兜幂俐囤霉奖赘挛视疆丈黔糖架邓各鼻丢产风铝络庇霄弃丈真峰陕蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质的沉淀性质的应用蛋白质的沉淀性质的应用盐溶与盐析：盐溶与盐析： 在蛋白质溶液中加入中性盐在蛋白质溶液中加入中性盐（如（如NaClNaCl、（、（NHNH4 4）2 2SOSO4 4等）时，可产等）时，可产生以下两种现象：在盐浓度很稀的范生以下两种现象：在盐浓度很稀的范围内，随着盐浓度增加，蛋白质的溶围内，随着盐浓度增加，蛋白质的溶解度亦随之增加，这种现象称解度亦随之增加，这种现象称盐溶盐溶。盐溶作用的发生是由于蛋白质表面电盐溶作用的发生是由于蛋白质表面电荷吸附盐离子之后，增强了蛋白质和荷吸附盐离子之后，增强了蛋白质和水的亲和力，促进蛋白质的溶解。水的亲和力，促进蛋白质的溶解。与盐溶作用相反，当溶液中盐浓度提与盐溶作用相反，当溶液中盐浓度提高到一定的饱和度时，蛋白质溶解度高到一定的饱和度时，蛋白质溶解度逐渐降低，蛋白质分子发生絮结，成逐渐降低，蛋白质分子发生絮结，成沉淀析出，这种现象称为沉淀析出，这种现象称为盐析盐析。 盐析作用的发生机理很复杂，盐析作用的发生机理很复杂，一般认为中性盐与水的亲和力大，又一般认为中性盐与水的亲和力大，又是强电解质，当一定高浓度的中性盐是强电解质，当一定高浓度的中性盐加到蛋白质溶液中时，一方面结合大加到蛋白质溶液中时，一方面结合大量自由水，降低水分活度；一方面又量自由水，降低水分活度；一方面又夺取蛋白质表面的水化膜，增强蛋白夺取蛋白质表面的水化膜，增强蛋白质分子之间互相作用的机会，促其聚质分子之间互相作用的机会，促其聚集絮结成沉淀析出。集絮结成沉淀析出。 利用盐析的原理，加中性盐使蛋白质利用盐析的原理，加中性盐使蛋白质沉淀的方法叫做沉淀的方法叫做盐析沉淀法盐析沉淀法。 不同蛋白质表面电荷量不同，水不同蛋白质表面电荷量不同，水化膜的厚度不一样，盐析所需要的中化膜的厚度不一样，盐析所需要的中性盐浓度也不一样，一般而言，相对性盐浓度也不一样，一般而言，相对分子质量大的容易盐析，相对分子质分子质量大的容易盐析，相对分子质量越小，所需盐浓度越高。根据这种量越小，所需盐浓度越高。根据这种性质，同一溶液中不同相对分子质量性质，同一溶液中不同相对分子质量的蛋白质，可通过逐步提高盐浓度的的蛋白质，可通过逐步提高盐浓度的方法逐一沉淀分离出来，这种方法称方法逐一沉淀分离出来，这种方法称为分级盐析。为分级盐析。铡擞陇比抵陈冷矩守纂幢热巢年缀干裸北铲忧藤康谐诺怖藏挽虹抗禄墓礼蛋白质一级结构蛋白质一级结构等电点盐析沉淀：等电点盐析沉淀：盐析与等电点结合盐析与等电点结合沉淀效果更好。一般是先将蛋白质溶沉淀效果更好。一般是先将蛋白质溶液的液的pHpH调至目的蛋白质的等电点。然调至目的蛋白质的等电点。然后再加固体后再加固体(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4或其饱和溶液，或其饱和溶液，使达到一定浓度后，蛋白质即可沉淀使达到一定浓度后，蛋白质即可沉淀析出。析出。竭鱼瞬腻讨迪锨润式踢杠宿潞享觅邮吩耶柬聂欣冶绥作手却盆射址喝裤宫蛋白质一级结构蛋白质一级结构有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀： 水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇等，水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇等，具有介电常数比较小，与水的亲和力具有介电常数比较小，与水的亲和力大，能以任何比例与水相溶等特点。大，能以任何比例与水相溶等特点。当向蛋白质水溶液中加入适量这类溶当向蛋白质水溶液中加入适量这类溶剂时，它能夺取蛋白质颗粒表面的水剂时，它能夺取蛋白质颗粒表面的水化膜，同时，还能降低水的介电常数，化膜，同时，还能降低水的介电常数，增加蛋白质颗粒间的静电相互作用，增加蛋白质颗粒间的静电相互作用，导致蛋白质分子聚集絮结沉淀。导致蛋白质分子聚集絮结沉淀。与盐析法类似，沉淀所需有机溶剂的与盐析法类似，沉淀所需有机溶剂的浓度也与蛋白质相对分子质量有关，浓度也与蛋白质相对分子质量有关，相对分子质量大的要求浓度低，相对相对分子质量大的要求浓度低，相对分子质量小的要求浓度高。不同相对分子质量小的要求浓度高。不同相对分子质量的混合溶液，可以通过调节分子质量的混合溶液，可以通过调节有机溶剂的浓度达到分级沉淀的目的。有机溶剂的浓度达到分级沉淀的目的。等电点有机溶剂沉淀：等电点有机溶剂沉淀： 有机密剂沉淀法若与等电点有机密剂沉淀法若与等电点结合，沉淀更易发生，而且彻底。先结合，沉淀更易发生，而且彻底。先将提取液将提取液pHpH调至目的蛋白质的等电点、调至目的蛋白质的等电点、再加有机溶剂到所得要的浓度，蛋白再加有机溶剂到所得要的浓度，蛋白质会很快沉淀析出。质会很快沉淀析出。注意：注意：在对蛋白质的影响方面，与盐在对蛋白质的影响方面，与盐析法不同。有机溶剂长时间作用于蛋析法不同。有机溶剂长时间作用于蛋白质会引起变性，因此，用这种方法白质会引起变性，因此，用这种方法进行操作时需要注意：（进行操作时需要注意：（1 1）低温操作。）低温操作。 （2 2）有机溶剂与蛋日质接触时间不能）有机溶剂与蛋日质接触时间不能过长，在沉淀完全的前提下，时间越过长，在沉淀完全的前提下，时间越短越好。短越好。殊级盘丘项阳涡走活饿邹尤辕锭篇毛崇凝羚脸族冷枣痔赫抵爬谍絮寂恍会蛋白质一级结构蛋白质一级结构失活沉淀：失活沉淀： 重金属盐沉淀重金属盐沉淀：当溶液：当溶液pHpH大大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，易与重金属离子（易与重金属离子（HgHg2+2+、PbPb2+2+、CuCu2+2+、AgAg+ +等）结合，生成不溶性盐类，沉淀等）结合，生成不溶性盐类，沉淀析出。误服重金属盐的病人，大量口析出。误服重金属盐的病人，大量口服牛奶、豆浆或蛋清能够解毒，就是服牛奶、豆浆或蛋清能够解毒，就是因为这些食物中的蛋白质与重金属离因为这些食物中的蛋白质与重金属离子形成不溶性盐，经催吐剂呕吐排出子形成不溶性盐，经催吐剂呕吐排出体外。达到解毒的目的。体外。达到解毒的目的。生物碱试剂沉淀生物碱试剂沉淀：当溶液的：当溶液的pHpH低于等低于等电点时，蛋白质分产是阳离子形式存电点时，蛋白质分产是阳离子形式存在。易与生物碱试剂（如苦味酸、鞣在。易与生物碱试剂（如苦味酸、鞣酸、磷钨酸、磷钼酸及三氯醋酸等）酸、磷钨酸、磷钼酸及三氯醋酸等）作用。生成不溶性盐沉淀，并伴随发作用。生成不溶性盐沉淀，并伴随发生蛋白质分子变性。实验室中常用这生蛋白质分子变性。实验室中常用这些试剂定性检验蛋白质或去除蛋白。些试剂定性检验蛋白质或去除蛋白。在啤酒生产工艺中借酒花中的单宁类在啤酒生产工艺中借酒花中的单宁类物质与蛋白质成盐沉淀，使麦汁得以物质与蛋白质成盐沉淀，使麦汁得以澄清，防止成品啤酒混浊。澄清，防止成品啤酒混浊。热凝固沉淀热凝固沉淀：蛋白质受热变性后，将：蛋白质受热变性后，将pHpH调至等电点，则很容易发生凝固沉淀。调至等电点，则很容易发生凝固沉淀。其原因是：由于变性蛋白质的空间结构其原因是：由于变性蛋白质的空间结构解体，疏水基团外露，水化膜破坏，同解体，疏水基团外露，水化膜破坏，同时由于等电点破坏了带电状态等而发生时由于等电点破坏了带电状态等而发生絮结沉淀。我国传统的做豆腐工艺是将絮结沉淀。我国传统的做豆腐工艺是将豆浆煮沸，点入少量盐卤（含豆浆煮沸，点入少量盐卤（含MgClMgCl2 2）或石膏（含或石膏（含CaSOCaSO4 4），或者点入酸浆或），或者点入酸浆或葡萄糖酸内酯将葡萄糖酸内酯将pHpH调至等电点，热变性调至等电点，热变性的大豆蛋白使很快絮结凝固，经过滤成的大豆蛋白使很快絮结凝固，经过滤成型则成豆腐。型则成豆腐。藉稀剥涸葵源喊帽搞小著畦妊芬隶晕面砍争鹿回吨励誊喇纷撕唐钉课墟戳蛋白质一级结构蛋白质一级结构5.蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应（1 1）双缩脲反应双缩脲反应 双缩脲是由两分双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到热到180180，则两分子尿素缩合成一，则两分子尿素缩合成一分子双缩脲，并放出一分子氨气。分子双缩脲，并放出一分子氨气。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，该反应称为产生红紫色络合物，该反应称为双缩双缩脲反应脲反应。蛋白质分子中含有许多和双。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩腺反应，形成红紫色络合物。通常缩腺反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应定性蛋白质，也可根据反可用此反应定性蛋白质，也可根据反应产生的颜色在应产生的颜色在540nm540nm处比色，定量测处比色，定量测定蛋白质。定蛋白质。（2 2）MillonMillon（米伦）（米伦）： 反应米伦试反应米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液。蛋白质溶液中加入米伦酸的混合液。蛋白质溶液中加入米伦试剂后立即产生白色沉淀，再加热后，试剂后立即产生白色沉淀，再加热后，沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故含有酪氨酸的蛋酪氨酸含有酚基，故含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。白质都有此反应。（3 3）黄色反应）黄色反应 ：这是含有酪氨酸和：这是含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸所特有的反应。色氨酸等芳香族氨基酸所特有的反应。蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱，颜色加深成桔黄色。这是因为硝碱，颜色加深成桔黄色。这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。（4 4）乙醛酸反应）乙醛酸反应 ：在含有蛋白质的：在含有蛋白质的溶液中加人乙醛酸，并沿试管壁慢慢溶液中加人乙醛酸，并沿试管壁慢慢注人浓硫酸，在两液层之间会出现紫注人浓硫酸，在两液层之间会出现紫色环，凡含有吲哚基的化合物都有这色环，凡含有吲哚基的化合物都有这一反应。色氨酸及含有色氨酸的蛋白一反应。色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应，但不含色氨酸的白明胶质有此反应，但不含色氨酸的白明胶就无此反应。就无此反应。（5 5）茚三酮反应）茚三酮反应 ：蛋白质和氨基酸：蛋白质和氨基酸一样，也能与水合前三酮反应，生成一样，也能与水合前三酮反应，生成蓝紫色化合物。实践中常利用这一反蓝紫色化合物。实践中常利用这一反应来检测蛋白质的存在。但不能区别应来检测蛋白质的存在。但不能区别蛋白质与氨基酸。蛋白质与氨基酸。（6 6）FolinFolin（福林）（福林）- -酚试剂反应酚试剂反应 ：蛋白质分子一般都含有酪氨酸，酪氨蛋白质分子一般都含有酪氨酸，酪氨酸中的酚基能将福林酸中的酚基能将福林- -酚试剂中的磷酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常用来定量测定蛋白质的含量。用来定量测定蛋白质的含量。（7 7）坂口反应）坂口反应 ： 蛋白质分子中的蛋白质分子中的精氨酸含有胍基，能与次氯酸钠或次精氨酸含有胍基，能与次氯酸钠或次溴酸钠及溴酸钠及a-a-萘酚在氢氧化钠溶液中产萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色物质。此反应用以测定精氨酸生红色物质。此反应用以测定精氨酸或含有精氨酸的蛋白质。或含有精氨酸的蛋白质。采萄霞构涸膛巍洁显醇依系饼宾劈琳妙宁赋耀憎籍瓶莎虽斯软缅上渺咕袒蛋白质一级结构蛋白质一级结构6.6.蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收一般蛋白质在一般蛋白质在280nm280nm波长处都都最大波长处都都最大的吸收率，这是由于蛋白质中有酪氨的吸收率，这是由于蛋白质中有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故。酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故。通常利用这些特异性的吸收，可以测通常利用这些特异性的吸收，可以测定蛋白质的浓度，如果没有干扰物质定蛋白质的浓度，如果没有干扰物质存在的话，可用来测定浓度为存在的话，可用来测定浓度为0.10.1一一0.5mg0.5mgmlml的蛋白质溶液。的蛋白质溶液。返回窗曾昧沦恕岿稗输锦割槐者疥惧胎屹弗迸楞柿憨期猎听虚铝呆左阜倾揍虞蛋白质一级结构蛋白质一级结构蛋白质相对分子量的测定蛋白质相对分子量的测定小分子化合物相对分子质量的测定方法小分子化合物相对分子质量的测定方法冰点降低法、沸点升高法或蒸汽压减小法冰点降低法、沸点升高法或蒸汽压减小法蛋白质是大分子胶体物质，这些方法不适用。蛋白质是大分子胶体物质，这些方法不适用。常用方法有：常用方法有：化学分析方法化学分析方法超离心沉降速度法超离心沉降速度法凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法店望然慧跪瞥壤龟材扎茄镁搏侗贷驹各螺需驹嘛捶届剪绊哨续槽磺孕船暮蛋白质一级结构蛋白质一级结构超离心沉降速度法超离心沉降速度法对蛋白质溶液进行对蛋白质溶液进行5 56 6万万r/minr/min的高的高速离心，蛋白质分子会向离心池底部速离心，蛋白质分子会向离心池底部方向移动，离心池上面为清液，清液方向移动，离心池上面为清液，清液与下面的溶液之间出现一个界面。用与下面的溶液之间出现一个界面。用光学方法测定界面移动的速度，即为光学方法测定界面移动的速度，即为蛋白质的蛋白质的离心沉降速度离心沉降速度。根据下面的。根据下面的公式可求出溶质的公式可求出溶质的沉降系数沉降系数。x x界面移动距离界面移动距离t t离心时间离心时间 角速度角速度S S沉降系数沉降系数由沉降系数由沉降系数S S可根据斯维得贝格可根据斯维得贝格（Sved bergSved berg）方程计算相对分子质）方程计算相对分子质量。量。沉降系数沉降系数S S的意义与应用的意义与应用沉降系数沉降系数S S是文献中经常使用的物理量。是文献中经常使用的物理量。其物理意义是溶质颗粒在单位离心场中其物理意义是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，量纲为秒。一个的沉降速度，量纲为秒。一个S S单位是单位是l10l10-13-13s s，相对分子质量越大，相对分子质量越大，S S越大。越大。蛋白质的沉降系数大都在蛋白质的沉降系数大都在1200S1200S之间。之间。当一种新发现的大分子，其结构、性质当一种新发现的大分子，其结构、性质和功能都处在研究过程中时，其名称未和功能都处在研究过程中时，其名称未定，为了描述方便，常用其沉降系数定，为了描述方便，常用其沉降系数S S来来表示。表示。芒纵屹纸懊描抗追虾督艰突茵厩疡亮拣涂熊扒牙鞘录福吝甜值宙恒校拐炉蛋白质一级结构蛋白质一级结构凝胶过滤法凝胶过滤法葡聚糖凝胶过滤法是测定蛋白质相对分子葡聚糖凝胶过滤法是测定蛋白质相对分子质量常用的方法之一，葡聚糖凝胶颗粒有质量常用的方法之一，葡聚糖凝胶颗粒有三维网状结构，一定型号的凝胶网孔大小三维网状结构，一定型号的凝胶网孔大小一定。只允许相应大小的分子进入凝胶颗一定。只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大分了随洗脱液从颗粒间隙先流下来，洗脱分了随洗脱液从颗粒间隙先流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，迟后洗脱下来，所以洗脱穿去，历程长，迟后洗脱下来，所以洗脱体积大。体积大。若用多种已知相对分子质量的标准蛋若用多种已知相对分子质量的标准蛋白质准确测得各自的洗脱体积（白质准确测得各自的洗脱体积（V Ve e），），以以V Ve e对相对分子质量对数作图，得标对相对分子质量对数作图，得标准曲线，再用同样条件测定未知样品准曲线，再用同样条件测定未知样品洗脱体积（洗脱体积（V Ve e），从标准曲线上可查），从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。凝胶出样品蛋白质的相对分子质量。凝胶过滤法可测定（过滤法可测定（180180）万范围内的）万范围内的相对分子质量，误差为相对分子质量，误差为55。但对。但对变性蛋白和线性分子不适用。变性蛋白和线性分子不适用。窄琳倪怜归笼督凶瓤妆底开誉豹小都邮每疫蔫刚遣吸屈佣亏呛奥屠室壤礁蛋白质一级结构蛋白质一级结构化学分析方法化学分析方法 此法是测定特征性化学成分，此法是测定特征性化学成分，计算最低相对分子质量。计算最低相对分子质量。首先利用化首先利用化学分析方法则定蛋白质中某一持殊成学分析方法则定蛋白质中某一持殊成分（某种元素或某种氨基酸）的百分分（某种元素或某种氨基酸）的百分含量。然后，假定蛋白质分子中该元含量。然后，假定蛋白质分子中该元素共有一个原子（或一分子某种氨基素共有一个原子（或一分子某种氨基酸），据其百分含量可计算出最低相酸），据其百分含量可计算出最低相对分子质量。对分子质量。 例如，测得细胞色素例如，测得细胞色素c c的铁元素的铁元素含量为含量为0.430.43，已知铁相对原子质量，已知铁相对原子质量为为55.855.8，则最小相对分子质量（，则最小相对分子质量（M M）为：）为：M M55.3100/0.431300055.3100/0.4313000 因为细胞色素因为细胞色素c c分子只有一个铁分子只有一个铁卟啉辅基，所以，计算结果与其他方卟啉辅基，所以，计算结果与其他方法测得的真实相对分子质最相当。法测得的真实相对分子质最相当。如果蛋白质分子中所含已知成分不是如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。例如，血最小相对分子质量的倍数。例如，血红蛋白分了中含铁红蛋白分了中含铁0.3350.335，计算出其，计算出其最低相对分子质量为最低相对分子质量为1.671.67万。只相当万。只相当于其他方法所得血红蛋白相对分子质于其他方法所得血红蛋白相对分子质量的量的1/41/4。可见，血红蛋白分子中实际。可见，血红蛋白分子中实际含有含有4 4个铁原子，其真实相对分子质量个铁原子，其真实相对分子质量为最小相对分子质量的四倍。为最小相对分子质量的四倍。券村邢铁械肿壮谨括肛确藤拉且褒掉沽勤茵镀氖绰际疽足从寸擅料歼圆诛蛋白质一级结构蛋白质一级结构SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法 普通蛋白质电泳的泳动速率取决普通蛋白质电泳的泳动速率取决予荷质比。若将蛋白质在烷基十二酯硫酸予荷质比。若将蛋白质在烷基十二酯硫酸钠（钠（SDSSDS）溶液中于）溶液中于100100热处理，并加巯热处理，并加巯基化合物将二硫键打开。则蛋白质变性，基化合物将二硫键打开。则蛋白质变性，伸展成棒状并与伸展成棒状并与SDSSDS结合而带上大量的负电结合而带上大量的负电荷，这样一来，蛋白质分子本身的原有电荷，这样一来，蛋白质分子本身的原有电荷就相对地不重要了。所结合的大量荷就相对地不重要了。所结合的大量SDSSDS负负电荷决定着分子的带电性质。蛋白质分子电荷决定着分子的带电性质。蛋白质分子大，结合大，结合SDSSDS多；分子小，结合多；分子小，结合SDSSDS少。因少。因此，不管分子大小，荷质比是相同的。此，不管分子大小，荷质比是相同的。在上述情况下，荷质比对不同分子量在上述情况下，荷质比对不同分子量的的SDS-SDS-蛋白质的电泳迁移率的影响不蛋白质的电泳迁移率的影响不会有什么差别了。凝胶的分子筛效应会有什么差别了。凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会产生不同的对长短不同的棒形分子会产生不同的阻力，这是影响迁移率的主要因素。阻力，这是影响迁移率的主要因素。同一电泳条件下，分子小，受阻小，同一电泳条件下，分子小，受阻小，泳动快，迁移率大。相对分子质量大泳动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小。者，迁移率小。进行进行SDS-SDS-蛋白电泳时，用一种染料蛋白电泳时，用一种染料（如溴酚蓝或甲基绿）作为前沿标志。（如溴酚蓝或甲基绿）作为前沿标志。电泳相对迁移率等于蛋白质泳动的距电泳相对迁移率等于蛋白质泳动的距离和原点到前沿距离的比值：离和原点到前沿距离的比值： R R与相对分子质量的对数成一定与相对分子质量的对数成一定比例关系，测定几种已知标准相对分比例关系，测定几种已知标准相对分子质量的子质量的R R，并对相对分子质量对数，并对相对分子质量对数作图，得一直线。根据未知相对分作图，得一直线。根据未知相对分 子质量的子质量的R R可从图上查得相对分子质可从图上查得相对分子质量。这种量。这种 方法速度快，样品用量方法速度快，样品用量 少，缺点是误差大，误少，缺点是误差大，误 差来源于迁移差来源于迁移距离的测量。距离的测量。波据射敝灶舶德积桅殴于瓮檀纺判每煤环冲院艘山宋龚缚择殊痔俭杖培逼蛋白质一级结构蛋白质一级结构重点复习：重点复习：1.1.氨基酸种类、结构特征、性质；氨基酸种类、结构特征、性质；2.2.蛋白质结构、结构与功能的关系；蛋白质结构、结构与功能的关系；3.3.等电点理论及其应用；等电点理论及其应用；4.4.蛋白质变性理论及其应用；蛋白质变性理论及其应用；5.5.氨基酸、蛋白质分离纯化技术的基氨基酸、蛋白质分离纯化技术的基本原理。本原理。6.6.氨基酸、蛋白质的主要鉴别反应。氨基酸、蛋白质的主要鉴别反应。芥蜀拨婴豆屏咨隙知兜溶孰硷源贤廷枚著信隘硫似第抿炽率捻秀搀哦滇灌蛋白质一级结构蛋白质一级结构Hi 下课了！旁宴抿乐尝襄蘸抒茎旦盎尼梁银议版桑易捂看货鞠哀坞割营飘矢卑嫉拔叹蛋白质一级结构蛋白质一级结构