黑皮质素4型受体在神经病理性疼痛中的作用青岛大学医学院附属医院麻醉科褚海辰 引言引言神经病理性疼痛的形成机制神经元神经元神经胶质细胞神经胶质细胞 引言引言n一直以来，“神经元论”在神经病理性疼痛机制的研究中占据了统治地位。n近年来，对星形胶质细胞的深入研究表明，其细胞膜上存在着大量离子通道、神经递质的受体，且其激活后能够产生和释放多种神经活性物质，在慢性疼痛的发展过程中起着重要的作用。 引言引言 外周外周神经神经损伤损伤星形星形胶质胶质细胞细胞激活激活可能是疼痛神经递质、可能是疼痛神经递质、神经调质、趋化因子神经调质、趋化因子如如 EAAs、ATP、P物物质、质、CGRP、NO、PGs、fractalking ？nHS014是一种选择性4-型黑皮质素受体(MC4R)拮抗剂。n近年来研究表明，黑皮质素肽类（MC）参与神经病理性疼痛的调节，且其主要是通过MC4R实现的。 引言引言引言引言n研究表明，在多种神经病理性疼痛实验中，外周或中枢（包括鞘内和脑室内）给予MC4R激动剂-MSH 和ACTH可致痛觉过敏。而其拮抗剂HS014和SHU9119则可产生抗痛觉过敏作用。引言引言 MC4R神经神经病理病理性疼性疼痛痛具体机制？具体机制？ 引言n随着星形胶质细胞在神经病理性疼痛中的重要作用的认识，且神经元和星形胶质细胞既表达MC4R也分泌其内源性激动剂-MSH。引言引言神经病理性疼痛神经病理性疼痛MC4R调节星形胶质调节星形胶质细胞的活性以细胞的活性以及促炎性因子及促炎性因子的表达的表达推测：推测：n为了证明以上推测：我们分别从细胞水平和动物水平在脊髓和脑（主要是中脑导水管周围灰质,PAG）两个部位对MC4R在胶质细胞的激活及其伤害性物质的释放中的作用进行了研究。实验设计分两部进行：n实验一：从细胞方面研究了黑皮质素4型受体在大鼠脊髓星形胶质细胞释放兴奋性氨基酸中的作用n实验二：从动物水平研究了中脑导水管周围灰质（PAG）4型黑皮质素受体在慢性坐骨神经压迫损伤引起胶质细胞激活及炎性因子分泌中的作用观察观察MC4RMC4R拮抗剂拮抗剂HS014HS014对对肿瘤坏死因子对对肿瘤坏死因子( ( TNF-)TNF-)激活的脊髓激活的脊髓ASTAST和吗啡慢性处理的脊和吗啡慢性处理的脊髓髓ASTAST释放释放EAAEAA的影响，以期阐明的影响，以期阐明HS014HS014在抑制在抑制疼痛和吗啡耐受与戒断反应过程中可能的作疼痛和吗啡耐受与戒断反应过程中可能的作用机制。用机制。实验一实验一第一部分：脊髓星形胶质细胞的体外原代培养及鉴定第一部分：脊髓星形胶质细胞的体外原代培养及鉴定第三部分：第三部分：HS014对被激活的星形胶质细胞释放兴奋性对被激活的星形胶质细胞释放兴奋性氨基酸的影响氨基酸的影响第二部分：高效液相第二部分：高效液相-串联四级杆质谱串联四级杆质谱(HPLC-MS/MS)方方法检测兴奋性氨基酸释放法检测兴奋性氨基酸释放第四部分：第四部分：HS014对吗啡慢性处理的星形胶质细胞释放对吗啡慢性处理的星形胶质细胞释放谷氨酸的影响谷氨酸的影响 主要研究内容主要研究内容实验动物n 1-2天新生Wistar大鼠，每批3-5只，清洁级。 主要试剂nDMEM/F12 Hyclone公司，美国n胰蛋白酶 SIGMA公司，美国nNeurobasal无血清培养液 Gibco公司，美国 nB27神经营养生长因子 Gibco公司，美国n10%特优胎牛血清 民海生物工程有限公司n单克隆兔抗鼠GFAP抗体 武汉博士德生物工程有限公司n封闭用正常山羊血清 北京中杉nFITC标记山羊抗兔IgG 北京中杉n多聚赖氨酸 Sigma公司，美国n谷氨酸标准品 Dr.Ehrenstorfer公司，德国n天门冬氨酸标准品 Dr.Ehrenstorfer公司，德国n乙腈 Merk公司，色谱纯试剂n醋酸铵 ACROS公司，分析纯试剂n纳洛酮 Sigma公司，美国n吗啡 沈阳第一制药厂n肿瘤坏死因子（TNF-） Peptotech公司，美国nHS014 Phoenix Pharmaceutical公司，美国脊髓星形胶质细胞原代培养及鉴定脊髓星形胶质细胞原代培养及鉴定 原代培养的原代培养的WistarWistar大鼠脊髓大鼠脊髓ASTAST接种后，接种后，细胞胞贴壁很固，突壁很固，突击光滑粗大，胞光滑粗大，胞体体较大，胞大，胞质较丰富，形状不丰富，形状不规则，折光性差，折光性差，细胞胞边界清楚，随着界清楚，随着细胞胞数目增多数目增多细胞胞间相互交叉呈网状，但相互交叉呈网状，但细胞立体性不胞立体性不强强，所以，所以镜下下层次感不次感不强强。星形胶质细胞免疫荧光鉴定细胞高表达星形胶质细胞的标志性蛋白(GFAP)，发绿色荧光，蓝光是DAPI复染的细胞核。HPLC-MS/MS方法检测EAA n 建立了一种快速测定星形胶质细胞建立了一种快速测定星形胶质细胞上清中兴奋性氨基酸释放的高效液相上清中兴奋性氨基酸释放的高效液相-串串联四级杆质谱（联四级杆质谱（HPLC-MS/MS）方法。）方法。使用高效液相使用高效液相-串联四极杆质谱的多反应串联四极杆质谱的多反应监测（监测（MRM）模式快速测定星形胶质细）模式快速测定星形胶质细胞（胞（AST）兴奋性氨基酸（）兴奋性氨基酸（EAAs）的释）的释放量。按照拟定的检测方法，检测结果放量。按照拟定的检测方法，检测结果如下：如下： 图1混合对照品TIC(1-天门冬氨酸，2-谷氨酸)HS014对被激活的星形胶质细胞释放兴奋性氨基酸的影响组别 谷氨酸天门冬氨酸C 组 3.1050.531 0.3360.047 T 组 10.1330.823* 1.1840.091* TH0.1组 6.9210.777# 0.7200.093# TH1 组 2.9120.4333# 0.4270.053# TH10组 2.2850.375# 0.2370.029# 与C组比，* P0.01，与T组比，# P0.01表2 各组细胞兴奋性氨基酸的释放量 （mol/L，n=6，s） HS014对被激活的星形胶质细胞释放兴奋性氨基酸的影响n采用液相质谱联用法（HPLC-MS/MS）检测上清液中兴奋性氨基酸的含量结果见表2, 与C组比较，T组Glu和Asp释放量有显著性差异（P0.01）与T组比较，TH0.1,TH1和TH10组Glu和Asp释放量显著减少（P0.01），并随着HS014预处理量的增加而逐渐减少。 组别0min30min60min120min对照组3.1340.432 3.2190.724 3.2570.437 3.3470.482 A组3.0570.675 3.2530.489 3.3520.576 3.5350.319 B组3.1780.578 4.5750.549*# 6.5280.527* 8.5150.735*# C组3.0790.512 3.2350.648 3.5350.762 3.8650.378 与A组比较，*P0.05，*P0.01；与B组比较，#P0.01，#P0.01表3 HS014和纳洛酮对星形胶质细胞释放谷氨酸的影响（mol/L，n=6，s）HS014对吗啡慢性处理的星形胶质对吗啡慢性处理的星形胶质细胞释放谷氨酸的影响细胞释放谷氨酸的影响结结结结 论论论论1 HS014能够减少TNF-激活的脊髓星形胶质细胞时Glu和Asp的释放量。2吗啡慢性处理的星形胶质细胞细胞后，Glu释放明显增多，纳洛酮能够增加Glu释放，HS014能抑制该反应。HS014对对CCI大鼠中脑导水管周围灰大鼠中脑导水管周围灰质星形胶质细胞激活及细胞因子表质星形胶质细胞激活及细胞因子表达的影响达的影响实验二研究目的研究目的检测GFAPCCI检测 IL-1 TNF-热痛痛阈值测定定HS014探讨探讨HS014对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及PAG中星形胶质细中星形胶质细胞的激活和炎性因子表达的影响。胞的激活和炎性因子表达的影响。 实验分组实验分组PAG置管后置管后7天天假手术组假手术组（A组，组，n=25只）只）CCI对照组对照组（B组，组，n=25只）只）CCI治疗组治疗组（C组，组，n=25只）只） 实验分组实验分组假手术组CCI对照组 CCI治疗组 -1h0d1d14d-1h 0d1d14d-1h 0d 1d14dHS014（5ug/0.5ul/只，每24h一次，连续注射至术后14d)CCI术后3d7d7d3d3d7dNS（0.5ul/次，每24h一次，连续注射至术后14d) 实验步骤实验步骤CCI模型制备模型制备热痛阈值测定热痛阈值测定GFAP检测检测IL-1和和TNF-检测检测PPAG置管置管大鼠大鼠PAG置管置管固定于脑立固定于脑立体定位仪体定位仪 牙托粉固定牙托粉固定大鼠麻醉大鼠麻醉暴露颅骨暴露颅骨PAG置管置管单笼喂养单笼喂养注：注：PAG单侧：(AP 7.68(AP 7.68，L0.6L0.6，H6.0 mm) H6.0 mm) 埋植不锈钢埋植不锈钢套管套管( (长长11mm11mm，外径，外径0.6mm)0.6mm)。套管尖端高于注射部位。套管尖端高于注射部位1.5mm1.5mm，套管内插入等长不锈钢管芯。，套管内插入等长不锈钢管芯。 PAG微量注射微量注射 用1ul微量注射器通过注射内管PAG注射 HS014或NS，每次注射容量均0.5ul，1min内匀速注完，留针1min，避免药液外漏. 大鼠大鼠CCICCI模型的制备模型的制备剪去体毛剪去体毛消毒右下肢消毒右下肢逐层缝合逐层缝合切口切口大鼠麻醉大鼠麻醉暴露坐骨暴露坐骨神经主干神经主干结扎坐骨结扎坐骨神经神经单笼喂养单笼喂养注：注：坐骨神经结扎：用用4-04-0的铬制羊肠线松扎的铬制羊肠线松扎4 4道道, , 间距为间距为1mm, 1mm, 结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动反应为宜。结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动反应为宜。热痛阈值测定热痛阈值测定 大鼠于术前及术后1，3，7，11，14天, 给药后60min内，采用热板测痛仪测试大鼠的热痛阈值。 结果结果 热痛阈值变化热痛阈值变化注：注：与术前比较，*P0.05 , *P0.01; 与B组比较, #P0.05, #P0.01C组C组C组分组 术前0d 术后1d 术后3d 术后7d 术后14d A 0.160.03 0.160.03 0.140.02 0.150.02 0.150.03 B 0.140.02 0.150.02 0.250.03* 0.330.05* 0.430.06* C 0.150.04 0.150.03 0.200.03*# 0.260.02*# 0.220.04*# 各组术后不同时间点各组术后不同时间点GFAP的表达的表达 (x s ) 注：与术前比较，*P0.05 ，*P0.01 ; 与B组比较, #P 0.05， #P 0.01 各组术后不同时间点各组术后不同时间点GFAP的表达的表达 各组各组PAG中中GFAP的表达的表达 SABC 染色染色 400B3B7A3A7A14B14C3C7C14 各组术后不同时间点各组术后不同时间点IL-1的表达的表达 ( s) 分组 术前0d 术后1d 术后3d 术后7d 术后14dA 10.803.77 11.002.12 11.803.35 10.802.78 11.803.27B 11.603.05 25.604.16* 28.005.52* 31.403.85* 40.406.66*C 12.004.06 20.402.61*# 21.803.77*# 24.602.30*# 23.42.61*# 注：与术前比较，*P0.05 ，*P0.01 ; 与B组比较, #P0.05， #P0.01 各组术后不同时间点各组术后不同时间点IL-1的表达的表达 各组各组PAG中中GFAP的表达的表达 SABC 染色染色 400 A1 A3A7B1B3B7C1C3C7A14B14C14 各组术后不同时间点各组术后不同时间点TNF-的表达的表达 ( s) 分组 术前0d 术后1d 术后3d 术后7d 术后14d A 10.003.16 11.403.78 10.401.52 10.802.17 11.802.59 B 12.603.36 21.003.54* 22.403.51* 31.204.21* 36.005.61* C 11.202.17 16.202.77*# 17.402.61*# 20.803.11*# 19.603.85*# 注：与术前比较，*P0.05 ，*P0.01 ; 与B组比较, #P 0.05，#P0.01 各组术后不同时间点各组术后不同时间点TNF-的表达的表达 各组各组PAG中中TNF-的表达的表达 SABC 染色染色 400A1A3A7A14B1B3B7B14C1C3C7C14 n最主要的是本研究发现： PAG给予HS014可明显抑制CCI后星形胶质细胞的激活及促炎性细胞因子的表达。n提示在外周神经损伤后，PAG中MC4R可能通过引起胶质细胞激活和促炎性细胞因子的分泌来参与神经病理性疼痛的调节。讨论讨论 讨论讨论 PAG中中MC4R参与神经病理性疼痛的可能机制：参与神经病理性疼痛的可能机制：MC4R激活激活星形胶质细胞激星形胶质细胞激活及炎性因子的活及炎性因子的的表达增加的表达增加PAG下行易化体系下行易化体系激活激活外外周周神神经经损损伤伤外外周周神神经经损损伤伤神神经经病病理理性性疼疼痛痛胶质细胞胶质细胞- -神经元网络神经元网络 1、CCI可致PAG中星形胶质细胞激活和炎性因子 的表达增加，且其增加程度与慢性神经病理性疼痛维持过程中热刺激缩足阈值的降低程度相平行。 2、HS04能明显降低PAG中星形胶质细胞的激活和炎性因子的增加，从而更为有效减轻CCI大鼠的痛觉过敏。 结论Melanocortin 4 Receptor Induces Hyperalgesia and Allodynia After Chronic Constriction Injury by Activation of p38 MAPK in DRGHaichen Chu,1 Jiangling Xia,1 Zhao Yang,2 and Jie Gao11Department of Anesthesiology, Affiliate Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao,Shandong Province, China International Journal of Neuroscience, 00, 18, 2011Copyright2011 Informa Healthcare USA, IncEffect of periaqueductal gray melanocortin 4 receptor in pain acilitation and glial activation in rat model of chronic constriction injuryHaichen Chu1, Junzhi Sun2, Hongmei Xu1, Zejun Niu1, 1Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, ChinaNeurological Research ner2905.3d 29/7/12 Melanocortin 4 Receptor Mediates Neuropathic Pain Through p38MAPK in Spinal CordHaichen Chu, Jiangling Xia, Hongmei Xu, Zhao Yang, Jie Gao, From the Department of Anesthesiology (HC, JX, HX, JG), Affiliate Hospital of Qingdao University Shandong Province, China. Can J neurol Sci. 2012; 39: 458-464Melanocortin 4 receptor antagonists attenuates morphine antiniciceptive tolerance, astroglial activation and cytokines expression in the spinal cord of ratZejun Niu Jagui Ma Haichen ChuNeuroscience LettersSpinal nerve lesion alters bloodspinal cord barrier function and activates astrocytes in the ratTorsten Gordh, Haichen Chu, Hari Shanker Sharma *Laboratory of Pain Research, Department of Surgical Sciences, Division of Anaesthesiology and Intensive Care Medicine Uppsala University Hospital, SE-75185, Uppsala, SwedenPain 124 (2006) 211221