第十章第十章 微生物的进化、系统发微生物的进化、系统发育和分类鉴定育和分类鉴定进化进化(evolution)：生物与其生存环境相互作用过程中，其遗传系统随时间发生一系列不可逆的改变，在大多数情况下，导致生物表型改变和对生存环境的相对适应。今天仍生存在地球上的生物种类，今天仍生存在地球上的生物种类，彼此之间都有或远或近的历史渊源。彼此之间都有或远或近的历史渊源。最原始的生命最原始的生命漫长的进化历程漫长的进化历程千姿百态的生物种类千姿百态的生物种类系统发育系统发育(phylogeny)：各类生物进化的历史。：各类生物进化的历史。分类分类(classification)：根据生物特性的相似程度：根据生物特性的相似程度 将其分群归类。将其分群归类。地球上的物种估计大约有地球上的物种估计大约有150万，其中微生物超过万，其中微生物超过10万种，万种，而且其数目还在不断增加。而且其数目还在不断增加。生物分类的二种基本原则：生物分类的二种基本原则：a）根据表型表型(phenetic)特征的相似程度分群归类，这种 表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生 物亲缘关系为目标；b）按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标 是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系 统发育的分类系统。从进化论诞生以来，已经成生物学家普遍接受的分类原则从进化论诞生以来，已经成生物学家普遍接受的分类原则生物系统学生物系统学(systematics)(systematics)第一节 进化的测量指征70年代以前，生物类群间的亲缘关系判断的主要根据：形态结构、生理生化、行为习性，等等少量的化石资料表型特征：一、进化指征的选择原核生物的特点：原核生物的特点：形体微小、结构简单、缺少有性繁殖过程，化石资料凤毛麟角b b）形态特征在不同类）形态特征在不同类群中进化速度差异很大，仅群中进化速度差异很大，仅 根据形态推断进化关系往往不准确；根据形态推断进化关系往往不准确；根据形态学特征推断微生物之间的亲缘关系的缺点：根据形态学特征推断微生物之间的亲缘关系的缺点：a a）由于微生物可利用的形态特征少，很难把所有）由于微生物可利用的形态特征少，很难把所有 生物放在同一水平上进行比较；生物放在同一水平上进行比较；虽然根据少量表型特征来推测各类微生物的亲缘虽然根据少量表型特征来推测各类微生物的亲缘关系而提出的许多分类系统，都随着时间的推移关系而提出的许多分类系统，都随着时间的推移而不断地被否定了。而不断地被否定了。六、七十年代：六、七十年代：分析和比较生物大分子的结构特征，特别是分析和比较生物大分子的结构特征，特别是蛋白质、蛋白质、RNARNA和和DNADNA这些反映生物基因组特征这些反映生物基因组特征的分子序列，作为判断各类微生物乃至所有的分子序列，作为判断各类微生物乃至所有生物进化关系的主要指征。生物进化关系的主要指征。分子计时器分子计时器(molecular chronometers)进化钟进化钟(evolutionary clock)蛋白质、蛋白质、RNA和和DNA序列进化变化的显著特点是进化序列进化变化的显著特点是进化速率相对恒定，也就是说，分子序列进化的改变量速率相对恒定，也就是说，分子序列进化的改变量(氨基酸或核苷酸替换数或替换百分率氨基酸或核苷酸替换数或替换百分率)与与分子进化的时间成正比。分子进化的时间成正比。1. 生物大分子作为进化标尺依据生物大分子作为进化标尺依据a）在两群生物中，如果同一种分子的序列差异很大时，在两群生物中，如果同一种分子的序列差异很大时，-进化距离远，进化过程中很早就分支了。进化距离远，进化过程中很早就分支了。b）如果两群生物同一来源的大分子的序列基本相同，）如果两群生物同一来源的大分子的序列基本相同，-处在同一进化水平上。处在同一进化水平上。2. 作为进化标尺的生物大分子的选择原则作为进化标尺的生物大分子的选择原则1）在所需研究的种群范围内，它必须是普遍存在的。2）在所有物种中该分子的功能是相同的。3）为了鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所 选择的分子序列必须能严格线性排列，以便进行进 一步的分析比较。4）分子上序列的改变（突变）频率应与进化的测量尺 度相适应。大量的资料表明：功能重要的大分子、或者大分子中功能重要大量的资料表明：功能重要的大分子、或者大分子中功能重要的区域，比功能不重要的分子或分子区域进化变化速度低。的区域，比功能不重要的分子或分子区域进化变化速度低。二、二、RNA作为进化的指征作为进化的指征16S rRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”：1）rRNA具有重要且恒定的生理功能；具有重要且恒定的生理功能；2）在）在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度 保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的 各类生物亲缘关系的研究；各类生物亲缘关系的研究；3）16SrRNA分子量大小适中，便于序列分析；分子量大小适中，便于序列分析；4）rRNA在细胞中含量大在细胞中含量大(约占细胞中约占细胞中RNA的的90%)，也易于提取；，也易于提取；5）16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同真核生物中其同 源分子是源分子是18SrRNA)。因此它可以作为测量各类生物进化的工具。因此它可以作为测量各类生物进化的工具。利用利用16SrRNA建立分子进化树的美国科学家建立分子进化树的美国科学家 Carl Woese 三、rRNA和系统发育树1. rRNA的顺序和进化的顺序和进化培养微生物培养微生物提取并纯化提取并纯化rRNArRNA序列测定序列测定分析比较分析比较微生物之间的系统发育关系微生物之间的系统发育关系2. 特征序列或序列印记（特征序列或序列印记（signature sequence）通过对通过对r RNA全序列资料的分析比较（特别是采用全序列资料的分析比较（特别是采用计算机）发现的在不同种群水平上的特异特征性寡计算机）发现的在不同种群水平上的特异特征性寡核苷酸序列，或核苷酸序列，或在某些特定的序列位点上出现的单在某些特定的序列位点上出现的单碱基印记。碱基印记。特征序列特征序列有助于有助于迅速确定某种微生物的迅速确定某种微生物的分类归属，或建立新的分类单位。分类归属，或建立新的分类单位。3. 系统发育树系统发育树(phylogenetic tree)通过比较通过比较生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为分子系统树，其特点是分子系统树，其特点是用一种树状分枝的图型来概括各用一种树状分枝的图型来概括各种种( (类类) )生物之间的亲缘关生物之间的亲缘关系。系。分枝的末端和分枝的连结点称为结分枝的末端和分枝的连结点称为结(node)(node)，代表生物类群，分枝末端的结代表仍生存的种类。系代表生物类群，分枝末端的结代表仍生存的种类。系统树可能有时间比统树可能有时间比例，或者用两个结之间的分枝长度例，或者用两个结之间的分枝长度变化来表示分子序列的差异数值。变化来表示分子序列的差异数值。16 S r RNA系统发育树系统发育树1）生命的第三种形生命的第三种形式式古生菌古生菌动物界和植物界动物界和植物界原核生物和真核生物（原核生物和真核生物（20世纪世纪60年代）年代）古细菌古细菌(archaebacteria)真细菌真细菌( (Eubacteria)真核生物真核生物(Eukaryotes)（1977，Carl Woese）Bacteria(细菌细菌)Archaea(古生菌古生菌)Eukarya(真核生物真核生物)（1990，Carl Woese）原核生物原核生物界（界（Kingdom）域（域（domain）3）三（界）三（界)域生物的主要特征域生物的主要特征三界理论虽然是根据三界理论虽然是根据16SrRNA16SrRNA序列的比较提出的，序列的比较提出的，但其他特征的比较研究结果也在一定程度上支持但其他特征的比较研究结果也在一定程度上支持了三了三界生物的划分。界生物的划分。第二节 细菌分类分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、研究和利用各种微生物资源也必须对它们进行分类。分类分类(classification)：根据一定的原则(表型特征相似性或系统发育相关性)对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定；(根据现有数据建立系统的过程根据现有数据建立系统的过程)分类学涉及三个相互依存又有区别的组成部分：鉴定鉴定分类、分类、命名、命名、命名命名(nomenclature)：是根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称；(分类系统建立过程中的步骤之一分类系统建立过程中的步骤之一)鉴定鉴定(identification或或determination)：借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。(根据现有系统确定未知微生物分类归属的过程根据现有系统确定未知微生物分类归属的过程)主要以细菌为例介绍微生物分类、命名和鉴定的有关知识一、分类单元及其等级一、分类单元及其等级界界门门纲纲目目科科属属种种常用的细菌分类学术语：1）培养物(culture)：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长 物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。2）菌株(strain)：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养 物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法(如通过诱变) 所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株， 以便与原来的菌株相区别。菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体（参见（参见P321）3）型(form或type)：常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。例如抗原特征的差异分为不同的血清型；对噬菌体裂解反应的不同分为不同的噬菌型等4）种（species）： 物种，生物分类中基本的分类单元和分类等级。高等生物中，“生殖隔离”被看作是区分物种的标准微生物的种：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其 他类群的菌株有很明显的区别。（参见（参见P321）二、微生物的命名二、微生物的命名双名法，由二个拉丁字或希腊字或拉丁化了的其它文字组成，双名法，由二个拉丁字或希腊字或拉丁化了的其它文字组成，一般用斜体表示一般用斜体表示（参见（参见 P 323）属名在前，一般用拉丁字名词表示，字首字母大写属名在前，一般用拉丁字名词表示，字首字母大写种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定到种，可用若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定到种，可用sp来表示，来表示，例如例如 Bacillus sp 伯杰氏手册伯杰氏手册伯杰氏鉴定细菌学手册伯杰氏鉴定细菌学手册(Bergeys Manual of Determinative Bacteriology)美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)1957年第七版后，由于越来越广泛地吸收了国际上细菌年第七版后，由于越来越广泛地吸收了国际上细菌分类学家参加编写分类学家参加编写(如如1974年第八版，撰稿人多达年第八版，撰稿人多达130多位多位，涉及，涉及15个国家；现行版本撰稿人多达个国家；现行版本撰稿人多达300多人，涉及近多人，涉及近20个国家个国家)，所以它的近代版本反映了出版年代细菌分类学，所以它的近代版本反映了出版年代细菌分类学的最新成果，因而逐渐确立了在国际上对细菌进行全面分的最新成果，因而逐渐确立了在国际上对细菌进行全面分类的权威地位。类的权威地位。伯杰氏系统细菌学手册伯杰氏系统细菌学手册(Bergeys Manual of Systematic Bacteriology)伯杰氏手册伯杰氏手册是目前进行细菌分类、鉴定的最重要依据，其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方法。（20世纪80年代末期）第三节第三节 微生物分类鉴定的特征和技术微生物分类鉴定的特征和技术血清学试验、噬菌体分型、生态特性、氨基酸顺序和蛋白质分析、对细胞壁等细胞成分的分析比较、通过原核生物的转化、转导、接合来判断原核生物的亲缘关系等等。参见 P 330-334核酸的碱基组成和分子杂交核酸的碱基组成和分子杂交特点：特点：与形态及生理生化特性的比较不同，对与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA的碱基的碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。（参见（参见P 332）1. DNA的碱基组成的碱基组成(G+Cmol%)DNA碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。分类学上，用分类学上，用G+C占全部碱基的分子百分数占全部碱基的分子百分数(G+Cmol%)来表示各类生物的来表示各类生物的DNA碱基因组成特征。碱基因组成特征。（参见（参见P 332）1）每个生物种都有特定的GC%范围，因此后者 可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围 为25-75%，变化范围最大，因此更适合于细 菌的分类鉴定。2）GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌 作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性， 从分子水平上判断物种的亲缘关系。3）使用原则：G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定否定每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，它们应该具有相似的G+C含量，若不同生物之间G+C含量差别大表明它们关系远。但具有相似但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。之间具有近的亲缘关系。同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在45%以下；同属不同种的差别应低于1015%；G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其菌株，如果其G+C含量的差别大于含量的差别大于5%，则肯定，则肯定不是同一个种，大于不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。则肯定不是同一个属。在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时，G+C含量是一项重要的，必不可少的鉴定指标。其分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特征和把那些G+C含量差别大的种类排除出某一分类单元。G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定否定2. 核酸的分子杂交不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近，反之亦然。t 直接分析比较DNA的碱基排列顺序t 核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生物DNA碱基排列顺序的相似性（参见（参见P 333）核酸分子杂交：a）DNA-DNA杂交；（亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较）b）DNA-rRNA杂交；（亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘关系比较）c）核酸探针；（利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定）（参见（参见P 333-334）第四节 微生物的快速鉴定和自动化分析1. 微量多项试验鉴定系统 （1）API 20 系统：法国 Bio-梅里埃公司生产，有 20 种不同的生化反应，可鉴定 700 多种细菌，分不同系列，如 20A厌氧菌，20E肠道菌 （2）Enterotube 系统：罗氏公司生产，有 15 种生化反应，专门鉴定肠道菌（3）Biolog 系统：美国安普公司生产，可自动化鉴定，可鉴定 1140 种细菌 本章小结本章小结进化、菌株、模式菌株、培养物、进化、菌株、模式菌株、培养物、 种（微生种（微生物）、物）、蛋白质和核酸被用作微生物进化谱系分析的蛋白质和核酸被用作微生物进化谱系分析的原因；原因；16S rRNA被认为是谱系分析的被认为是谱系分析的“分子尺分子尺”的的原因；原因；