组织化学组织化学 histochemistry特殊染色特殊染色, 通过应用某些能与组织通过应用某些能与组织细胞化学成分特异性结合的显色细胞化学成分特异性结合的显色试剂试剂,定位地显示病变组织细胞的定位地显示病变组织细胞的特殊化学成分特殊化学成分,同时又能保存原有同时又能保存原有的形态改变的形态改变, 达到形态与代谢的结达到形态与代谢的结合合.可用于检测细胞内的酶类、糖类、可用于检测细胞内的酶类、糖类、脂类、核酸、某些金属元素等。脂类、核酸、某些金属元素等。糖糖 的的 组组 织织 化化 学学糖的分类糖的分类1.单糖和双糖单糖和双糖2.多糖：淀粉、纤维素、糖原多糖：淀粉、纤维素、糖原3.粘液物质（粘多糖）粘液物质（粘多糖） 中性粘多糖中性粘多糖 酸性粘多糖酸性粘多糖4.糖蛋白糖蛋白 粘蛋白粘蛋白 氨基己糖氨基己糖4% 糖蛋白糖蛋白 氨基己糖氨基己糖4%5. 糖脂糖脂 含有半乳糖含有半乳糖, 脂肪酸脂肪酸,神经氨基醇神经氨基醇糖糖 原原一一. 糖原的概念糖原的概念l 由多糖衍化而来，是天然存在于动物组由多糖衍化而来，是天然存在于动物组织内的多糖织内的多糖l 分布：胞浆内分布：胞浆内 肝、心肌、骨骼肌肝、心肌、骨骼肌l 同种葡萄糖的聚合物同种葡萄糖的聚合物l 作为糖原染色的切片，必须冰冻或经特作为糖原染色的切片，必须冰冻或经特殊固定液固定后进行切片殊固定液固定后进行切片二二.固定剂的选用固定剂的选用1.Carnoy（冷冷4） 无水乙醇无水乙醇 60ml 防止糖原溶于水防止糖原溶于水 氯氯 仿仿 30ml 增加渗透力增加渗透力 冰冰 醋醋 酸酸 10ml 抵消乙醇对组织的抵消乙醇对组织的 收缩、硬脆作用收缩、硬脆作用 *优点：固定迅速，保存肝糖原优点：固定迅速，保存肝糖原 2. Gendre （冷冷4） 苦味酸无水乙醇饱和液苦味酸无水乙醇饱和液 80ml 甲醛甲醛 15ml 冰醋酸冰醋酸 5ml临用前混合配制临用前混合配制3. Lillie固定液（固定液（AAF） 无水乙醇无水乙醇 85ml 冰醋酸冰醋酸 5ml 甲醛甲醛 10ml 固定液预冷固定液预冷4，固定，固定24h后，后，95%乙乙醇脱水，包埋醇脱水，包埋三三.固定中注意事项固定中注意事项1.尽可能取小块新鲜组织及时固定，不用尽可能取小块新鲜组织及时固定，不用水溶性固定液水溶性固定液2.应用含酒精的溶液作为固定液，但最好应用含酒精的溶液作为固定液，但最好不单独使用乙醇固定，以乙醇为溶剂的不单独使用乙醇固定，以乙醇为溶剂的混合固定液固定为佳混合固定液固定为佳3.固定原理：使糖原与固定液之间相结合固定原理：使糖原与固定液之间相结合的蛋白质凝固，糖原被周围凝固的蛋白的蛋白质凝固，糖原被周围凝固的蛋白质膜保护起来，质膜保护起来，四四.显示糖原的方法显示糖原的方法 1. 碘染色碘染色 2. 胭脂红染色胭脂红染色 *3. 过碘酸过碘酸-Schiff 反应反应 4. 银浸染法银浸染法过碘酸过碘酸-Schiff 反应反应Periodicacid-Schiff, PAS(一）染色原理一）染色原理l过碘酸是一种强氧化剂，能氧化糖分子，过碘酸是一种强氧化剂，能氧化糖分子，使相邻二个碳原子上的羟基（使相邻二个碳原子上的羟基（-OH）变为变为醛基（醛基（-COOH）lSchiff氏试剂是付品红（碱性品红）经氏试剂是付品红（碱性品红）经SO2作用后，形成的无色溶液作用后，形成的无色溶液付品红付品红Schiff试剂试剂l当当Schiff氏试剂与醛基作用后，形成含有氏试剂与醛基作用后，形成含有发色基团的化合物，呈现紫红色沉淀发色基团的化合物，呈现紫红色沉淀*PAS反应的基本原理反应的基本原理 1. 通过过碘酸的氧化作用，将糖分通过过碘酸的氧化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基子中的碳键打断，游离出醛基 2. 醛基与醛基与Schiff试剂反应显出红色试剂反应显出红色沉淀沉淀(二二) 染色步骤染色步骤1.切片脱蜡至水切片脱蜡至水2.1%过碘酸溶液内氧化过碘酸溶液内氧化5-10min3.流水洗流水洗5min, 再用蒸馏水洗再用蒸馏水洗4.用用Schiff试剂处理试剂处理10-20min5.流水洗流水洗10min6.复染复染(可用可用Mayer明矾苏木素或甲基绿衬染细明矾苏木素或甲基绿衬染细胞核胞核)7.脱水、透明、封片脱水、透明、封片切片经二甲苯和各级酒精复水后，入0.5%的过碘酸溶液中作用15分钟，取出后水洗。切片充分洗净后入Schiffs试剂中进行显色。作用15分钟左右，将切片取出水洗，为洗去非特异性着色，将切处理品入三级新配制的亚硫酸中进行冲洗，取出后水洗，镜检。 肝糖原肝糖原-PAS染色染色 X200 肝糖原肝糖原- PAS+苏木素复染苏木素复染 X200【结果】【结果】 胞浆内胞浆内PAS阳性物质呈紫红色，颗粒状阳性物质呈紫红色，颗粒状或均质团块状，胞核呈蓝色或绿色或均质团块状，胞核呈蓝色或绿色 红色深浅反应含糖原量的多少红色深浅反应含糖原量的多少【对照】【对照】 采用淀粉酶或唾液酶消化切片采用淀粉酶或唾液酶消化切片 对照片对照片PAS（-），），未处理片（未处理片（+）PAS反应阳性物质反应阳性物质物质类别物质类别举例举例染色强度染色强度多糖多糖糖原糖原强强中性粘液物质中性粘液物质结肠杯状细胞结肠杯状细胞强强某些酸性粘液物质某些酸性粘液物质酸性非硫酸性含酸性非硫酸性含唾液粘多糖唾液粘多糖中中基底膜基底膜肾小球基底膜肾小球基底膜中中色素色素脂褐素脂褐素中中脂质脂质脑苷脂脑苷脂中中淀粉样物淀粉样物淀粉样物淀粉样物弱弱软骨软骨软骨软骨弱弱真菌真菌曲菌曲菌强强脑垂体脑垂体粘液样细胞粘液样细胞强强This normal glomerulus is stained with PAS to highlight basement membranes. The capillary loops of the glomerulus are well-defined and thin. A888 kidney 11-PASA888 kidney 14-PAS（三）（三）PAS反应的应用反应的应用l证明与鉴别细胞内空泡样变性证明与鉴别细胞内空泡样变性 （水变性、脂肪变性、糖原）（水变性、脂肪变性、糖原）l心肌病变及其它心血管疾病的诊断和研究心肌病变及其它心血管疾病的诊断和研究l糖原累积病的诊断及研究糖原累积病的诊断及研究l糖尿病的诊断及研究糖尿病的诊断及研究l某些肿瘤的诊断与鉴别某些肿瘤的诊断与鉴别肝细胞水变性肝细胞水变性肝脂肪变性肝脂肪变性 (石蜡切片石蜡切片)肝脂肪变性肝脂肪变性 (冰冻切片冰冻切片)脂肪特染：苏丹脂肪特染：苏丹III糖原累积症糖原累积症 PAS（+） PAS（-） 肝细胞癌肝细胞癌 胆管癌胆管癌 横纹肌瘤横纹肌瘤 颗粒细胞肌母细胞瘤颗粒细胞肌母细胞瘤 Ewing肉瘤肉瘤 骨的网织细胞肉瘤骨的网织细胞肉瘤 （四）注意事项（四）注意事项1.过碘酸溶液与过碘酸溶液与Schiff试剂均可反复使用多次，试剂均可反复使用多次，用后密封放入冰箱用后密封放入冰箱4保存保存2.新鲜配成的溶液与应用过的作用时间不同，新鲜配成的溶液与应用过的作用时间不同，刚配成的作用时间短，以后逐渐延长刚配成的作用时间短，以后逐渐延长3.过碘酸溶液在作用前应与室温接近，温度过碘酸溶液在作用前应与室温接近，温度太低，造成氧化不全，影响效果太低，造成氧化不全，影响效果4. Schiff试剂如呈淡红色，则应弃去重配试剂如呈淡红色，则应弃去重配5. Schiff试剂配法很多，区别不大，可以试剂配法很多，区别不大，可以随意选用随意选用6. Schiff试剂作用时，染色缸必须加盖，试剂作用时，染色缸必须加盖，不然不然Schiff试剂将因试剂将因SO2消失而失效消失而失效Schiff试剂试剂 碱性复红碱性复红 1g 1N盐酸盐酸 20ml 偏重亚硫酸钠偏重亚硫酸钠 1g 重蒸馏水重蒸馏水 200ml粘粘 液液 物物 质质(粘粘 多多 糖糖) 人体的各种腺体及其他许多组织、细人体的各种腺体及其他许多组织、细胞，如结缔组织、纤维母细胞、软骨胞，如结缔组织、纤维母细胞、软骨基质等都能合成和分泌粘液物质，统基质等都能合成和分泌粘液物质，统称为称为粘多糖粘多糖 或或粘液粘液分类分类l中性粘多糖中性粘多糖l酸性粘多糖酸性粘多糖 1.硫酸化粘液物质硫酸化粘液物质 结缔组织结缔组织 （强）（强） 上皮上皮 （弱）（弱） 2.非硫酸化粘液物质非硫酸化粘液物质 含己糖醛酸的结缔组织粘液物质含己糖醛酸的结缔组织粘液物质 含唾液酸的上皮粘液物质含唾液酸的上皮粘液物质 粘液物质染色在诊断中的应用粘液物质染色在诊断中的应用1.用于一般粘液性病变的观察用于一般粘液性病变的观察2.肿瘤的诊断与研究：用显示粘液的肿瘤的诊断与研究：用显示粘液的染色方法进行观察和鉴别染色方法进行观察和鉴别l胃粘膜上皮分泌中性粘液，而胃肠上皮化胃粘膜上皮分泌中性粘液，而胃肠上皮化生或肠型胃癌细胞分泌酸性粘液生或肠型胃癌细胞分泌酸性粘液 -AB-PAS染色区分中性与酸性粘多糖染色区分中性与酸性粘多糖l酸性粘多糖含有硫酸基团和羧基。用阳离酸性粘多糖含有硫酸基团和羧基。用阳离子染料与酸性基团结合形成盐键而显色。子染料与酸性基团结合形成盐键而显色。利用染液不同的利用染液不同的PH值及不同的电解质浓度，值及不同的电解质浓度，可以区别酸性粘多糖的二种基团可以区别酸性粘多糖的二种基团 -HID-AB法法1.不同不同PH的的竞争性抑制竞争性抑制 PH2.5时，二种酸性粘多糖均被奥蓝着色时，二种酸性粘多糖均被奥蓝着色 PH1.0时，仅硫酸粘多糖着色时，仅硫酸粘多糖着色2.电解质浓度与粘液物质着色的关系电解质浓度与粘液物质着色的关系 MgCl2浓度浓度 显示物显示物 0.06M 羧酸和硫酸化粘液羧酸和硫酸化粘液 0.3M 弱和强硫酸化粘液弱和强硫酸化粘液 0.5M 强硫酸化粘液强硫酸化粘液 0.7M 强硫酸化结缔组织粘液强硫酸化结缔组织粘液 0.9M 硫酸角质硫酸角质 显示糖分子和酸性基团的显示糖分子和酸性基团的 组化方法组化方法1.奥蓝奥蓝-过碘酸过碘酸Schiff氏法氏法（AB-PAS）【目的】【目的】鉴别胃粘液（中性粘多糖）和肠鉴别胃粘液（中性粘多糖）和肠粘液（酸性粘多糖）；对鉴定肠上皮化粘液（酸性粘多糖）；对鉴定肠上皮化生有一定意义生有一定意义【染色原理染色原理】l 奥蓝是一种水溶性氰化亚钛铜盐，带有奥蓝是一种水溶性氰化亚钛铜盐，带有阳电荷，与组织中的酸根结合形成盐键。阳电荷，与组织中的酸根结合形成盐键。l AB-PAS法：首先酸性粘多糖为奥蓝染法：首先酸性粘多糖为奥蓝染色，不再与色，不再与PAS发生反应；仅中性粘多发生反应；仅中性粘多糖为糖为PAS阳性阳性【染色步骤染色步骤】1.石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗2.1%奥蓝的醋酸（奥蓝的醋酸（3%）液染）液染30分钟（分钟（PH约约2.5）3.蒸馏水洗蒸馏水洗4.1%过碘酸液氧化过碘酸液氧化5-10min5.蒸馏水洗蒸馏水洗6.Schiff试剂作用试剂作用10-30min7.流水洗流水洗10min8.脱水，透明，封片脱水，透明，封片Alcin blue染色液：染色液： 奥蓝奥蓝1g，蒸馏水蒸馏水97ml，冰醋酸冰醋酸3ml 临用前过滤使用，调节临用前过滤使用，调节PH2.5-3之间之间【结果】【结果】 中性粘多糖（胃粘液）呈红色，酸性中性粘多糖（胃粘液）呈红色，酸性粘多糖（肠粘液）呈蓝色，酸性和中性粘多糖（肠粘液）呈蓝色，酸性和中性混合粘液呈紫红色混合粘液呈紫红色 AB-PAS X100AB-PAS X2002.高铁双胺高铁双胺-奥蓝法（奥蓝法（HID-AB）法法【目的】【目的】 主要用于鉴别硫酸化粘多糖和唾液酸粘主要用于鉴别硫酸化粘多糖和唾液酸粘多糖，对确定肠化生类型有一定价值多糖，对确定肠化生类型有一定价值正常胃粘膜上皮，十二指肠腺正常胃粘膜上皮，十二指肠腺中性粘液中性粘液小肠小肠氮乙酰化唾液酸粘液氮乙酰化唾液酸粘液大肠大肠氧乙酰化唾液酸粘液和硫酸粘液氧乙酰化唾液酸粘液和硫酸粘液肠型胃癌肠型胃癌 唾液酸粘液唾液酸粘液 硫酸粘液硫酸粘液弥漫型胃癌弥漫型胃癌 中性粘液中性粘液高分化腺癌高分化腺癌 硫酸粘液硫酸粘液中低分化腺癌中低分化腺癌 唾液酸粘液唾液酸粘液大肠型化生大肠型化生 硫酸粘液硫酸粘液小肠型化生小肠型化生 不含硫酸粘液不含硫酸粘液高铁双胺染液高铁双胺染液 N，N-二甲基二甲基-间间-苯二胺二盐酸盐苯二胺二盐酸盐 120mg N，N-二甲基二甲基-对对-苯二胺二盐酸盐苯二胺二盐酸盐 20mg 溶于预热至溶于预热至25的蒸馏水的蒸馏水50ml中，再加入中，再加入60% FeCl3.6H20 1.5ml (PH1.4-1.5)【染色原理】【染色原理】 二胺盐离解后带阳电荷，与硫酸化粘液物质二胺盐离解后带阳电荷，与硫酸化粘液物质结合成复合物而显色。结合成复合物而显色。 该反应缓慢，需加入该反应缓慢，需加入FeCl3作为催化剂作为催化剂 FeCl3的作用的作用 -使二胺盐氧化形成棕黑色阳离子色原，加快染色使二胺盐氧化形成棕黑色阳离子色原，加快染色 -使染色液的使染色液的PH降至降至1.4 以后奥蓝（以后奥蓝（PH2.5）把羧基化的唾液酸粘液把羧基化的唾液酸粘液染成蓝色染成蓝色 【染色步骤染色步骤】1.切片脱蜡至水切片脱蜡至水2.蒸馏水洗蒸馏水洗3.入双胺溶液入双胺溶液 28 18-24小时小时4.自来水稍洗，蒸馏水洗自来水稍洗，蒸馏水洗5.入入3%冰醋酸水溶液（冰醋酸水溶液（PH2.5） 3min 6.奥蓝染液奥蓝染液30min7.流水洗流水洗5min8.蒸馏水洗蒸馏水洗9.脱水，透明，封片脱水，透明，封片【结果】【结果】 硫酸粘液呈棕黑色，含羧基的唾液酸粘硫酸粘液呈棕黑色，含羧基的唾液酸粘液呈蓝色，中性粘液不着色液呈蓝色，中性粘液不着色胃胃 -Spicer高铁双胺法高铁双胺法 X200