-菌种管理制度菌种管理制度1、目的 建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。2、适用围 本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购置、保存、传代、使用及销毁等。3、定义标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻枯燥菌。传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种， 用于传代及制备工作用菌种。工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后， 作为日常工作使用的菌种。菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基， 每萌发一次即称为一代， 从菌种保藏中心获得的冷冻枯燥菌种为第 0 代。4、职责4.1 部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。4.2 微生物检验员负责菌种确实认、传代、使用及销毁。5、规程5.1 菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购置方案包括临时检验需要 ，填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省市药检所购置冻干菌种标准菌株或传代用菌种，购置时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。5.2 菌种的接收菌种到达实验室后， 由部门主管接收菌种， 检查其名称和数量， 以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在标准菌株库存记录上，容包括：名称、数量、编号无编号者按检定菌种的编号原则编号 、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于48冰箱中，在一周必须完成转种。5.3 菌种的保存5.3.1 工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至 48冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：36 个月转种一次；丝状真菌每年转种一.z.-次。5.3.2 传代用菌种的保存采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。5.3.2.1 甘油冷冻管保存法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔， 并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于 10 号比浊管，向已制备好的菌悬液中参加等体积的无菌甘油浓度20% ，即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2 代G2 。可以每隔2 年转种一代。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复，挑取纯菌落传代或工作用。此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌 。5.3.2.2 液体石蜡保存法5.3.2.2.1 无菌液体石蜡的制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，在 121灭菌 30 分钟,置 40恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。5.3.2.2.2 液体石蜡管的制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养完毕后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管，并使石蜡高出菌种外表约 1cm 使菌体与空气隔绝， 并将试管直立， 置于-20冷冻或 28冰箱中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的保存如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等 。5.3.3 各菌种的保存方法、条件及期限，见下表 1表 1 传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限菌种名称大肠埃希菌CMCC(B)44102金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003铜绿假单胞菌CMCCB10104枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50094白色念珠菌CMCC(F)98001黑曲霉菌CMCC(F)980035.4 菌种的处理和保藏.z.保存方法保存温度保存期限甘油冷冻管-302 年液体石蜡管2-81 年-5.4.1 标准菌株的复、确认、传代标准菌株的复5.4.1.1.1 物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及 75%酒精棉球。5.4.1.1.2 培养基改良马丁琼脂培养基：用于黑曲霉复、复壮；液体硫乙醇酸盐培养基：用于生孢梭菌复、复壮；营养肉汤培养基：用于金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复、复壮；改良马丁培养基：用于白色念珠菌复、复壮标准菌株的复操作步骤：以下操作均在生物平安柜进展。a)在安瓿的外外表用 75%的酒精擦拭并让其自然风干。b)用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂 。c)以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取 0.50.8 ml 到安瓿中。d)轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。e)用无菌吸管将安瓿菌液全部转接到相应的液体培养基。f)根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度细菌培养温度3035，培养 1824 小时；真菌培养温度2328，培养35 天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复生长；假设不浑浊，细菌应延长培养时间至 7 天，真菌应延长培养时间至 14 天，假设仍未浑浊，灭菌处理。g)假设黑曲霉为菌悬液，则先放置室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管液体 12 滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置 2328培养 57 天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用含有 0.05%ml/ml的吐温-80 的 0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。h)取经复后的上述细菌菌液 8-10ml 至液体培养基中按 f项操作对菌种进展复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中参加 100ml20%的无菌甘油混匀，12ml/管，分装于冻存管。每个菌种制备 10 支，按顺序进展编号，最后一支做为质控管进展质量控制，即进展相应确实认，其余作为储藏管在-30冷冻条件下保存。黑曲霉按g项下方法进展复壮，制成复壮后的孢子悬液 20ml。以无菌技术向复壮后的菌种菌悬液中 12ml/管加石蜡高出菌种外表约 1cm 使菌体与空气隔绝，并将试管直立，封存于冻存管，置于-20冷冻或28冰箱中保存。制备 10 支，按顺序进展编号， 最后一支做为质控管进展质量控制，即进展相应确实认。其余作为储藏管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。i)储藏菌种管制备成功，储存于30，有效期为两年。标准菌株确实认.z.-a)用无菌接种环取上述培养物接种到胰酪大豆胨琼脂TSA培养基细菌或沙氏葡萄糖琼脂培养基真菌和酵母菌平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上。b)然后在 3035下培养 3 天细菌 ；2025下培养 5 天真菌和酵母菌 。c)培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划 4 个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进展保存和鉴定。d)鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。e)假设在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。应根据其原因采取措施重新别离挑选纯菌落。f)菌种确实认结果，记录在菌种鉴定记录上。g)各菌种的复活、划线用培养基、培养条件，见 菌种复活、划线用培养基、培养条件 2 。5.4.1.3 菌种的传代标准菌株的传代a)按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适宜的增菌培养基，称第1 代G1 ，复壮后转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，别离单个纯种菌落，此为第 2 代G2 。b)菌种确认后， 挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管或液体石蜡管， 作为保存菌种G2 ，也称传代用菌种，同时挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第 3 代W3 。c)将第 2 代G2菌种管冷冻保存，将工作用菌W3于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。d)取一支冷冻保存的第 2 代G2菌种转种于平板和斜面培养基上。平板上的菌种制成冷冻保存管第 3 代G3 ；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种，此仍为第 3 代W3 。e)将第 3 代菌种G3冷冻或低温保存，将生长、转种后的第 2 代G2菌种经高温灭活处理后丢弃。f)按上述规程操作，直至 G4 转为 W5 为止，需重新开启冷冻枯燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。g)当工作用菌种代数小于 5 时， 在规定保存期限， 可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。5.4.传代用菌的传代将购回无异常的传代用菌种一般为第 3 代 ，根据日常检验工作的需要量，挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种(为第 4 代)，同时，结合菌种的代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液按5.3.2的方法制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支，作为传代用菌种仍为第 3 代 。.z.-传代用菌的传代操作步骤 从冰箱冷藏室28中取出菌种斜面后，应温室放置约 30min。 将装有新鲜配制的培养基和传代菌种一并移入生物平安柜， 翻开紫外灯照射1小时。 关闭紫外灯。酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种环，将接种环烧红约 30s，工作用菌种的传代当工作用菌种代数小于 5 时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。取在冰箱 48保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代，并将新传代的培养物替代原有的菌种， 作为工作用菌种。 也可取用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法保存的菌种，进展复，直接作为工作用菌种。细菌每 1 个月传代一次；酵母菌每 2 个月传代一次；霉菌及芽胞每 3 个月传代一次。当超过 5 代，须用传代用菌种传代。本卷须知：传代时注意无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丧失。同时实验人员也要采取有效的预防措施进展自我保护，如工作时必须穿工作服，佩带无菌手套，实验完成以后消毒实验进展的区域、实验仪器和器具。如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤，微生物学检验人员应立即向部门主管报告以便及时进展处理。5.4.5 传代后，按检定菌种的编号原则编号，并在每一支菌种管上贴上标签，标签容包括：名称、编号、代数、传代日期、操作人、有效期。交部门主管统一保管。同时及时填写菌种传代记录附表 2 。5.5 检定菌种的编号采用字母加数字表示：英文缩写字母代次传代日期顺序号菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌E.c 、金黄色葡萄球菌S.a 、枯草芽孢杆菌B.s 、白色念珠菌C.a 、黑曲霉菌A.n 、乙型副伤寒沙门菌S.p代数用一位带有下标数字的字母表示：传代用菌种用 G 表示； 工作用菌种用 W 表示； 如 G3 表示传代用菌种第 3 代；W3 表示工作用菌种第 3 代。传代日期用 6 位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。如：2015 年 1 月 12日传代的第一支大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为 E.c-G3-120112-01。5.6 检定菌种的保管5.6.1 检定菌种设专人加双锁保管，并对所保存的菌种建立检定菌种保存、领用登记台账附表 3 。5.6.2 检定菌种的定期检查与鉴定在菌种的保存期间，工作日应每天检查保存菌种冰箱的温度、必要时检查菌种管的塞子是否松动，是否染杂菌等，并及时填写检定菌种观察记录附表 4 ，如有异常应及时处理。菌种在保存期均应根据菌种的特性工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每三个月一次检查其菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形态，必要时检查生化特性等工程，假设发现与原菌种变异较大，应重新别离、纯化、鉴定、再加以保存，并做好检定菌种鉴.z.-定记录附表 5 。5.6.3 所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应。5.7 检定菌种的使用5.7.1 微生物学检验人员根据检验需要，需到部门主管领取工作用菌种或传代用菌种，同时填写检定菌种保存、领用登记台账。5.7.2 微生物学检验人员从部门主管领取工作用菌种或传代用菌种，用于日常检验或验证试验，使用后及时填写检定菌种使用登记台账附表 6 ，以便追踪菌种使用历史。5.7.3 菌液的制备：将新鲜的斜面菌种培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为10-100cfu/ml 的菌悬液，置于04冰箱冷藏，用于阳性对照实验，使用期24h，浓菌液放冰箱可保存一周。5.8检定菌种废弃的销毁5.8.1 以下情况的菌种或培养物或被污染的器具等，必须采用121、45 分钟湿热灭活处理：a、新一代菌种制备成功后的上一代菌种；b、使用完后的菌种和带有标准菌株的器具和培养物；c、超过有效期的菌种；d、凡被污染、变异、可疑等异常情况菌种；e、其他应废弃的菌种。5.8.2 废弃菌种的销毁由微生物检验员提出申请，交部门主管批准后，进展灭活处理，并有其他人在场监视，并填写废弃菌种物品销毁处理记录附表 7 。6、相关文件：初始污染菌检查标准操作规程、 纯化水检测标准操作规程、 中国药典标准操作规程等。7、本卷须知：8.1、微生物检验人员最好生物相关专业，要经过培训，取证上岗。8.2、购置菌种要保存相关证明，最好让药检所开个证明，说明购置菌种的名称、菌种代数、数量等，把这个证明附在菌种承受记录后。8.3、菌种的传代、使用在阳性操作间，为保护菌种和人员，最好使用生物平安柜。8.4、菌种常用的是 10-100cfu/ml 的菌悬液，可根据预实验，确定制备方法。如果是细菌：可参照麦氏标准管进展估算。从孵育 18-24 小时的非选择性培养基上，挑取 3-5 个菌落，直接用肉汤或盐制成悬液作为接种，一般将浊度调整至麦氏比浊标准管 10 号对应浓度，然后稀释。麦氏比浊管配制方法：0.048MBaCL2(1.17%W/VBaCL2 2H2O) 、0.36NH2SO4(1%V/V)将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存，用前混匀。有效期为 6 个月。应用时，可目测或使用比浊仪即可。0.z.-号管对应的菌浓度为 30108cfu/ml，稀释一般用无菌生理盐水0.9%氯化钠溶液 。8、附表附表 1：检定菌接收记录附表 2：检定菌种传代记录附表 3：检定菌种保存、领用登记台账附表 4：检定菌种观察记录附表 5：检定菌种鉴定记录附表 6：检定菌种使用登记台账附表 7：废弃菌种物品销毁处理记录附表 1：检定菌接收记录：鉴定菌种接收记录鉴定菌种接收记录文件 BJ-QR-WJ013-A1接收日期备注：附表 2：检定菌种传代记录检定菌种传代记录检定菌种传代记录文件 BJ-QR-WJ013-A1名称及编号法传 代 用数量其中菌种菌种操作过程：操作人：复核人：附表 3：检定菌种保存、领用登记台账检定菌种保存、领用登记台账检定菌种保存、领用登记台账文件 BJ-QR-WJ013-A1名称及编号传代日期传代数量.z.名称及编号数量代数来源检查情况保 存 条接收人件传代日期传代数量编号编号传代用培养基传代用培养基传代前菌种保存方工 作 用数量传代前菌种保存方-法传 代 用数量其中菌种菌种操作过程：接收人/日期：移交人/日期：领取领取日期剩余数量名称及编数量号用途领取人发放人工 作 用数量编号编号传代用培养基传代用培养基传代菌种共发放，应剩余，实查。工作菌种共发放，应剩余，实查。接收人/日期：移交人/日期：备注：附表 4：检定菌种观察记录日期备注：附表 5：检定菌种鉴定记录检定菌种鉴定记录检定菌种鉴定记录文件 BJ-QR-WJ013-A1菌种名称及编号鉴定原因【鉴定工程】菌落形态革兰染色显微镜下形态典型生化特征鉴定结果：操作人：复核人：年 月 日附表 6：检定菌种使用登记台账.z.冰箱温度 塞子是否松动是否染菌处理措施记录人开场鉴定日期-检定菌种使用登记台账检定菌种使用登记台账文件 BJ-QR-WJ013-A1领用日期备注：附表 7：废弃菌种物品销毁记录废弃菌种物品销毁记录废弃菌种物品销毁记录文件 BJ-QR-WJ013-A1日期被处理菌种物品名销毁原因处理方式销毁人销毁监视人起草人：审核人：批准人：名称及编号数量使用人所检产品批号备注：废弃菌种要标明编号、数量支.z.