知识结构知识结构(对应学生用书对应学生用书P154)选修选修 现代生物科技专题现代生物科技专题知识研读知识研读(对应学生用书对应学生用书P154)专题专题基因工程基因工程( (一一) )1基因工程的诞生。2基因工程的原理及技术。3DNA的粗提取与鉴定。课程标准课程标准(即时巩固解析为教师用书独有)考点一考点一基因工程的基本工具一、与DNA分子相关的酶 种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键 磷酸二酯键碱基对间的氢键作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子考点整合考点整合二、载体1作用(1)作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。(2)利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。2具备的条件(1)能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。(2)有多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。(3)具有某些遗传标记基因，以便进行筛选。3种类(1)质粒：一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。(2)噬菌体的衍生物。(3)动植物病毒。【归纳总结】一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。【案例1】(2009福建理综)转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa等四种限制酶切割位点。请回答：(1)构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶_，对_进行切割。(2)培养基中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有_，作为标记基因。(3)香蕉组织细胞具有_，因此，可以利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。图中依次表示组织培养过程中香蕉组织细胞的_。【解析】本题主要考查基因工程的相关知识。(1)由于限制酶Sma的切割位点在抗病基因中间，因此不能用限制酶Sma来进行切割目的基因。要将目的基因从含抗病基因的DNA分子中切割下来，从图中看需要用限制酶Pst和EcoR同时进行切割。而运载体要和目的基因含有相同的黏性末端才能进行连接，所以质粒也要用限制酶Pst和EcoR同时进行切割。(2)由于卡那霉素能抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，所以构建的基因表达载体A中应含抗卡那霉素基因，作为标记基因。(3)由于香蕉组织细胞具有全能性，因此利用植物组织培养技术可将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成植株。 【答案】(1)Pst 、EcoR 含抗病基因的DNA、质粒 (2)抗卡那霉素基因 (3)全能性脱分化、再分化 【即时巩固1】(2010江苏)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制酶BamHHindEcoRSma识别序列及切割位点GGATC CC CTAGGAAGCT TT TCGAAGAATT CC TTAAGCCCGGGGGGCCC(1)一个图1所示的质粒分子经Sma切割前后，分别含有_个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越_。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是_。(4)与只使用EcoR相比较，使用BamH和Hind两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_。(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_。(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在_的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。【解析】本题综合考查基因工程的过程及应用。(1)质粒是双链环状DNA分子，在Sma切割前没有游离的磷酸基团，Sma作用于两个核苷酸之间的磷酸二酯键，切割产生的DNA片段末端是平末端，因而质粒经切割后含有2个游离的磷酸基团。(2)质粒的热稳定性主要由氢键的数量决定，氢键数量越多，质粒的热稳定性越高，反之则低，DNA分子中A与T之间存在2个氢键，C与G之间存在3个氢键，因此DNA分子中GC碱基对越多，热稳定性就越高，Sma识别CCCGGG序列，并在C和G之间将这段序列切开，也就是质粒中Sma酶切位点越多，GC碱基对越多，热稳定性越高。(3)据图1可知，Sma切割的位点在抗生素抗性基因之中，抗生素抗性基因是标记基因，应尽量避免破坏，据图2可知Sma切割的位点在目的基因之中,破坏了目的基因,所以不能使用Sma切割。(4)用同种限制酶切割后的质粒和目的基因,在基因表达载体构建时，常形成三种直接方式，其中目的基因与目的基因的连接、质粒与质粒的连接是无效的连接，用两种限制酶可避免此类现象。(5)基因表达载体的构建过程中需加DNA连接酶，连接脱氧核糖和磷酸。(6)抗生素抗性基因属于标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。(7)目的基因是蔗糖转运蛋白基因，将其导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后，应进行目的基因的检测与鉴定，可根据受体细胞是否含有蔗糖转运蛋白，即是否具备吸收蔗糖的能力判断基因工程是否成功，因而可在含有蔗糖(唯一碳源)的培养基中培养。 【答案】(1)0、2(2)高 (3)Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因 (4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 (5)DNA连接(6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞(7)蔗糖为唯一含碳营养物质考点二基因工程基本操作程序分析一、目的基因的获取途径1直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库中获取。2人工合成目的基因常用的方法有：(1)已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。(2)以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。3PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶等不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子二、基因表达载体的构建1基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。2基因表达载体的构建方法三、将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定1分子水平检测(1)导入检测：DNA分子杂交技术，即使用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作探针检测。2个体生物学水平鉴定：对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。【案例2】(2008海南)如图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答： (1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切,酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_、_、_三种。若要从这些连接物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行_。(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_。(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是_，其合成的产物是_。(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_。【解析】目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切后黏性末端相同，可以连接成目的基因与目的基因、目的基因与载体、载体与载体，需要分离纯化才能得到重组质粒。EcoRI酶切破坏了载体中的四环素抗性基因，只有载体与载体转化的原核宿主细胞在含四环素的培养基中能生长。因为青霉素基因没有被破坏，所以目的基因与载体、载体与载体转化的原核宿主细胞在含青霉素的培养基中能生长。EcoRI和BamHI酶切后有2种黏性末端，不能任意连接。 【答案】(1)目的基因载体连接物载体载体连接物目的基因目的基因连接物分离纯化(其他合理答案也可以) (2)载体载体连接物目的基因载体连接物、载体载体连接物 (3)启动子mRNA(4)EcoRI和BamHI【即时巩固2】(2008广东)天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类,用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题：(1)将淀粉酶基因切割下来所用的工具是_，用_将淀粉酶基因与载体拼接成新的DNA分子，下一步将该DNA分子_，以完成工程菌的构建。(2)若要鉴定淀粉酶基因是否插入酿酒酵母菌，可采用的检测方法是_；若要鉴定淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶，可采用_检测；将该工程菌接种在含淀粉的固体平板培养基上，培养一定时间后，加入碘液，工程菌周围出现透明圈,请解释该现象发生的原因。_。(3)如何进一步鉴定不同的转基因工程菌菌株利用淀粉能力的大小？_。(4)微生物在基因工程领域中有哪些重要作用？_。 【解析】本题考查了与基因工程相关的知识。将基因切割下来的工具是限制酶，将基因与运载体结合在一起的是DNA连接酶，基因工程的基本流程是：获取目的基因，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定。目的基因的检测与鉴定包括分子水平的检测，如用DNA分子杂交技术来检测基因或对应的mRNA，用抗原抗体杂交来检测蛋白质，也包括个体生物学水平的鉴定。淀粉在工程菌分泌的淀粉酶的作用下被分解，加入碘液后，因工程菌周围无淀粉而不变蓝，故出现透明圈。 【答案】(1)限制性核酸内切酶DNA连接酶导入酿酒酵母菌 (2)DNA分子杂交抗原抗体杂交或淀粉酶活性该工程菌产生的淀粉酶可分泌至培养基中，培养基中淀粉被水解的区域，遇碘不再变蓝色，产生透明圈 (3)测定相同培养条件下不同工程菌菌株的淀粉酶活性或酒精产量(4)工具酶主要来自微生物；最重要的目的基因供体库之一；目的基因的载体之一；作为受体细胞；提供用于发酵的工程菌知识研读知识研读(对应学生用书对应学生用书P157)基因工程(二)1基因工程的应用。2蛋白质工程。课程标准课程标准(即时巩固解析为教师用书独有)考点一基因工程的应用成果一、植物基因工程的成果1抗虫转基因植物：主要抗虫基因有Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。抗虫棉、抗虫番茄、抗虫烟草都已获得成功，既减少了杀虫剂的使用，又保护了环境。2抗病毒转基因植物：主要抗病毒的病毒外壳基因、病毒的复制酶基因、抗真菌的几丁质酶基因和抗毒素合成基因。考点整合考点整合多种抗病毒植株已培育成功并开始进行田间实验、栽培。 3抗逆转基因植物：主要有抗盐碱、抗干旱的渗透压调节基因、耐寒的抗冻蛋白基因、抗除草剂基因等，减轻了不利环境条件对农业生产造成的影响。 4利用转基因改良植物品质：主要成果有培育赖氨酸含量较高的玉米、耐储存的番茄、花色变异的矮牵牛花等。 二、动物基因工程的成果 1提高动物生长速度：导入外源生长激素基因、培育转基因绵羊和转基因鲤鱼。 2改善畜产品的品质：如导入肠乳糖酶基因，生产低乳糖乳汁。3用转基因动物生产药物：利用乳腺反应器生产抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等医药产品。4用转基因动物作器官移植的供体：利用基因工程抑制抗原决定簇基因的表达或除去抗原决定基因，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。三、基因工程药物利用转基因工程菌生产出人类蛋白质药物。四、基因治疗 项目类型外源基因类型及举例过程特点成果举例体外基因治疗腺苷酸脱氨酶基因从病人体内获得某种细胞细胞培养体外完成基因转移筛选并扩增培养重新输入患者体内操作复杂，但成功率高治疗复合型免疫缺陷症体内基因治疗治疗遗传性囊性纤维化病的基因外源基因载体携带体内相应组织细胞操作简单，成功率低治疗遗传性囊性纤维化病【案例1】(2009江苏)苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。(1)将图中的DNA用Hind、BamH限制酶切后，反应管中有_种DNA片段。(2)图中表示Hind与BamH酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得_种重组质粒；如果换用Bst与BamH酶切，目的基因与质粒连接后可获得_种重组质粒。(3)目的基因插入质粒后，不能影响质粒的_。(4)图中的Ti质粒调控合成的vir蛋白，可以协助带有目的基因的TDNA导入植物细胞，并防止植物细胞中_对TDNA的降解。(5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异性受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞_。(6)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的_基因频率的增长速率。【解析】本题考查基因工程的相关知识。(1)图中的DNA有1个Hind酶切位点和2个BamH酶切位点，故用Hind、BamH完全酶切后，反应管中有4种DNA片段。(2)从图中可知，Hind、BamH酶切后有2种片段有相应的末端,可与质粒重组；而Bst和BamH酶切后只有1种片段有相应的末端，可与质粒重组。(3)质粒要进行复制才能更多的表达出产物，所以重组之后要能复制。(4)酶具有专一性，TDNA的降解酶为DNA水解酶。(5)生物的细胞表面的受体具有特异性，人类肠上皮细胞没有昆虫肠上皮细胞表面的特异性受体，所以该毒素蛋白对人类的风险相对较小。(6)自然选择是普遍存在的，纯种种植自然选择会使害虫抗性基因频率快速增长，所以混合种植能降低害虫的抗性基因频率的增长速率。 【答案】(1)4(2)21(3)复制(4)DNA水解酶(5)表面无相应的特异性受体(6)抗性 【即时巩固1】(2008山东理综)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育了耐盐水稻新品系。(1)获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的_处，DNA连接酶作用于_处。(填“a”或“b”)(2)将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和_。(3)由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用_技术，该技术的核心是_和_。(4)为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的_作探针进行分子杂交检测，又要用_方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。【解析】本题以社会的热点和科技新进展为背景，通过转基因水稻的培育综合考查了基因工程的基本工具、基本操作程序和植物细胞工程等知识，属于识记内容，要求简单。(1)限制性核酸内切酶破坏的是相邻两个脱氧核苷酸之间的化学键。DNA连接酶的作用部位也是该处，但作用与限制酶正好相反。(2)重组DNA分子导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，也可以使用基因枪法或花粉管通道法。(3)目的基因的受体细胞是植物体细胞或受精卵，因此，要经过植物组织培养过程才能成为植株。该过程的核心是脱分化和再分化。(4)目的基因是否导入受体细胞，用DNA分子杂交技术进行检测，即以带有放射性的目的基因的单链为探针，检测受体细胞中是否含有能与探针进行配对杂交的DNA(目的基因)。检测目的基因是否表达，可以用个体检验的方法,将植物栽培到高浓度盐的环境中(如盐碱地)，然后观察其生活状况。 【答案】(1)aa(2)基因枪法(花粉管通道法) (3)植物组织培养脱分化(去分化)再分化 (4)耐盐基因(目的基因)一定浓度盐水浇灌(移栽到盐碱地中)考点二蛋白质工程与基因工程的比较 项目区别与联系蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系(1)蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程(2)基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造【案例2】2008年诺贝尔化学奖授予了三位在研究绿色荧光蛋白(GFP)方面做出突出贡献的科学家。绿色荧光蛋白能在蓝光或紫外光的激发下发出荧光。借助GFP发出的荧光就可以跟踪蛋白质在细胞内部的移动情况，帮助推断蛋白质的功能。GFP基因可作为目的基因用于培育绿色荧光小鼠，如图表示培育绿色荧光小鼠的基本流程：请根据上述材料回答下列问题：(1)用于培育绿色荧光小鼠的基因表达载体的组成必须有启动子、_、_和_等。图中过程常用的方法是_；过程利用的生物技术是_；在进行过程前，利用_可以获得数目更多且基因型相同的绿色荧光小鼠。(2)GFP基因与目的基因一起构建到载体上不影响目的基因的表达，也不影响由目的基因控制合成的蛋白质的结构与功能，且对细胞无毒性，因此GFP基因可以作为基因表达载体上的_。(3)目前科学家们通过_工程制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等，该工程是直接改造GFP分子，还是改造GFP基因？_。该工程的基本流程是_。【解析】基因表达载体由4部分组成，分别是目的基因、启动子、终止子、标记基因。把目的基因导入动物受体细胞的常用方法是显微注射技术。由受精卵培养得到早期胚胎，这属于细胞培养技术，可以利用胚胎分割技术由一个胚胎获得多个胚胎。GFP基因不影响目的基因控制合成的蛋白质的结构与功能，且对细胞无毒性，又可以发出荧光，因此可以作为标记基因。蛋白质工程是指通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，获得各种各样的自然界中没有的蛋白质。蛋白质工程的基本流程：预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应基因的脱氧核苷酸序列修饰(合成)相应的基因表达出相应蛋白质。 【答案】(1)GFP基因终止子标记基因显微注射法早期胚胎培养技术胚胎分割(2)标记基因 (3)蛋白质GFP基因预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应基因的脱氧核苷酸序列修饰(合成)相应的基因表达出相应蛋白质 【即时巩固2】胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，要经过较长的时间才能进入血液，而进入血液的胰岛素又容易分解，因此，治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图回答有关问题： (1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新的胰岛素模型的主要依据是_。 (2)通过DNA合成形成的新基因应与_结合后转移到_中才能得到准确表达。(3)若要利用大肠杆菌生产速效胰岛素，需用到的生物工程有_和发酵工程。(4)用蛋白质工程生产的胰岛素，与天然胰岛素比较，显著的优点是_。(5)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是什么？【解析】(1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计，因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是预期胰岛素的功能，即速效胰岛素。(2)合成的目的基因应与载体构建基因表达载体后导入受体细胞中才能得以表达。(3)利用蛋白质工程生产自然界原本不存在的蛋白质，需对原有的胰岛素进行改造，根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，人工合成新的胰岛素基因，形成目的基因，改造好的目的基因需通过基因工程来生产基因产物，并且在生产过程中要借助工程菌，所以还需要进行发酵，因此该过程涉及蛋白质工程、基因工程和发酵工程。(4)由题中信息可知，利用蛋白质工程技术生产的胰岛素解决了天然胰岛素在体内不能长期起作用的缺点。(5)由新的蛋白质模型到构建新的基因，其基本设计思路是根据新的蛋白质中氨基酸的序列，推测出基因中的脱氧核苷酸序列。然后用DNA合成仪直接合成出新的基因。【答案答案】(1)蛋白质的预期功能(2)载体大肠杆菌等受体细胞(3)蛋白质工程(4)具有长效性(5)根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪来合成出新的胰岛素基因。