第六章第六章 蛋白质工程及其在食品蛋白质工程及其在食品工业中的运用工业中的运用概述蛋白蛋白质是是对生命至关重要的一生命至关重要的一类生物生物大分子物大分子物质，各种生命功能、生命景象、，各种生命功能、生命景象、生命活生命活动都和蛋白都和蛋白质有关。在生命有机有关。在生命有机体催化、运体催化、运动、构造、构造、识别和和调理等理等许多方面，起着关多方面，起着关键的作用。的作用。酶酶.几乎全都是蛋白质。几乎全都是蛋白质。肌肉收缩、精子挪动、细胞分裂过程中的染色体挪动肌肉收缩、精子挪动、细胞分裂过程中的染色体挪动.高等生物的有序生长和分化过程。高等生物的有序生长和分化过程。抗体蛋白能识别和结合特异性的外源物质，使人体具抗体蛋白能识别和结合特异性的外源物质，使人体具备抵抗各种细菌、真菌和病毒的才干。备抵抗各种细菌、真菌和病毒的才干。由神经细胞膜蛋白构成的离子通道，担任神经激动的由神经细胞膜蛋白构成的离子通道，担任神经激动的构成和传导。构成和传导。血红蛋白具有结合和释放氧的才干，是血液中氧、二血红蛋白具有结合和释放氧的才干，是血液中氧、二氧化碳和氢离子的携带者。氧化碳和氢离子的携带者。另外，人体的毛发和指甲属于角蛋白，而血栓是由血另外，人体的毛发和指甲属于角蛋白，而血栓是由血纤蛋白单体聚合而成的。纤蛋白单体聚合而成的。蛋白质的生物学功能1.1.催化功能：酶催化功能：酶2.2.调理功能：激素调理功能：激素3.3.构造功能：皮、毛、骨、牙、细胞骨架构造功能：皮、毛、骨、牙、细胞骨架4.4.运输功能：血红蛋白运输功能：血红蛋白5.5.免疫功能：免疫球蛋白免疫功能：免疫球蛋白6.6.运动功能：鞭毛、肌肉蛋白运动功能：鞭毛、肌肉蛋白7.7.贮藏功能：酪蛋白贮藏功能：酪蛋白8.8.生物膜功能：及神经传导等生物膜功能：及神经传导等蛋白质是生命的表达者，分开了蛋白质，生命将蛋白质是生命的表达者，分开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需求进展改造。由于蛋白质是由的往往不尽人意，需求进展改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序衔接而成的，每一种蛋白质许多氨基酸按一定顺序衔接而成的，每一种蛋白质有本人独特的氨基酸顺序，所以改动其中关键的氨有本人独特的氨基酸顺序，所以改动其中关键的氨基酸就能改动蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体基酸就能改动蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决议的，只需改动构成遗传密码的一个或两个密码决议的，只需改动构成遗传密码的一个或两个碱基就能到达改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一碱基就能到达改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需求，对担任编码某种个重要途径就是根据人们的需求，对担任编码某种蛋白质的基因重新进展设计，使合成的蛋白量变得蛋白质的基因重新进展设计，使合成的蛋白量变得更符合人类的需求。更符合人类的需求。一、蛋白质工程的崛起的缘由一、蛋白质工程的崛起的缘由1 1、基因工程、基因工程产物物 基因工程在原那么上只能消基因工程在原那么上只能消费自然界自然界已存在的蛋白已存在的蛋白质。 这些天然蛋白些天然蛋白质是生物在是生物在长期期进化化过程中构成的程中构成的, ,它它们的构造和功能符合特定的构造和功能符合特定物种生存的需求物种生存的需求, ,却不一定完全符合人却不一定完全符合人类消消费和生活的需求。和生活的需求。实例实例1 1：玉米中赖氨酸的含量比较低：玉米中赖氨酸的含量比较低 假假设对赖氨酸合成氨酸合成过程中的两个关程中的两个关键酶进展改造展改造, ,可以使玉米叶片和种子中的游离可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分氨酸分别提高提高5 5倍和倍和2 2倍。倍。缘由：由：赖氨酸合成氨酸合成过程中两个关程中两个关键酶天冬氨酸激天冬氨酸激酶和二和二氢吡吡啶二二羧酸合成酸合成酶的活性，受的活性，受细胞内胞内赖氨酸氨酸浓度的影响。当度的影响。当赖氨酸氨酸浓度到达一定量度到达一定量时，就会抑制，就会抑制这两两种种酶的活性。的活性。实例实例2:2:工业用酶工业用酶在已研在已研讨过的几千种的几千种酶中，只需极少数可以运用于工中，只需极少数可以运用于工业消消费，绝大多数大多数酶都不能运用于工都不能运用于工业消消费，这些些酶虽然在自然形状下有活性，但在工然在自然形状下有活性，但在工业消消费中没有活性中没有活性或活性很低。或活性很低。这是由于工是由于工业消消费中每一步的反响体系中每一步的反响体系中中经常会有酸、碱或有机溶常会有酸、碱或有机溶剂存在，反响温度存在，反响温度较高，高，在在这种条件下，大多数种条件下，大多数酶会很快会很快变性失活。提高蛋白性失活。提高蛋白质的的稳定性是工定性是工业消消费中一个非常重要的中一个非常重要的课题。普通。普通来来说，提高蛋白，提高蛋白质的的稳定性包括：延伸定性包括：延伸酶的半衰期，的半衰期，提高提高酶的的热稳定性，延伸定性，延伸药用蛋白的保管期，抵御由用蛋白的保管期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。失等。3、蛋白质工程产物n n是自然界本来不存在的新的蛋白质。是自然界本来不存在的新的蛋白质。 他知道人类蛋白质组方案吗？它与蛋白质工程有他知道人类蛋白质组方案吗？它与蛋白质工程有什么关系？我国科学家承当了什么义务？什么关系？我国科学家承当了什么义务？ 人人类蛋白蛋白质组方案是方案是继人人类基因基因组方案之方案之后，生命科学乃至自然科学后，生命科学乃至自然科学领域一域一项艰苦的苦的科学命科学命题。20012001年，国年，国际人人类蛋白蛋白质组组织宣告成立。之后，宣告成立。之后，该组织正式提出启正式提出启动了两了两项艰苦国苦国际协作行作行动：一：一项为哪一哪一项由中国由中国科学家科学家牵头执行的行的“人人类肝肝脏蛋白蛋白质组方案；方案；另一另一项为哪一哪一项以美国科学家以美国科学家牵头执行的行的“人人类血血浆蛋白蛋白质组方案，由此拉开了人方案，由此拉开了人类蛋蛋白白质组方案的帷幕。方案的帷幕。“人人类肝肝脏蛋白蛋白质组方案是国方案是国际上第一个人上第一个人类组织器官的蛋白器官的蛋白质组方案，由我国方案，由我国贺福福初院士初院士牵头，这是中国科学家第一次是中国科学家第一次领衔的的艰苦国苦国际科研科研协作方案，作方案，总部部设在北京，目在北京，目前有前有1616个国家和地域的个国家和地域的8080多个多个实验室室报名参名参与。它的科学目的是提示并确与。它的科学目的是提示并确认肝肝脏的蛋白的蛋白质，为艰苦肝病苦肝病预防、防、诊断、治断、治疗和新和新药研研发的突破提供重要的科学根底。的突破提供重要的科学根底。人人类蛋白蛋白质组方案的深化研方案的深化研讨将是将是对蛋白蛋白质工程的有力推工程的有力推进和和实际支持。支持。 思索：对天然蛋白质进展改造，他以为应该直接对蛋思索：对天然蛋白质进展改造，他以为应该直接对蛋白质分子进展操作，还是经过对基因的操作来实现？白质分子进展操作，还是经过对基因的操作来实现？应该从从对基因的操作来基因的操作来实现对天然蛋白天然蛋白质改造，改造，主要主要缘由如下：由如下：1 1任何一种天然蛋白任何一种天然蛋白质都是由基因都是由基因编码的，的，改造了基因即改造了基因即对蛋白蛋白质进展了改造，而且改造展了改造，而且改造过的蛋白的蛋白质可以可以遗传下去。假下去。假设对蛋白蛋白质直接改造，直接改造，即使改呵斥功，被改造即使改呵斥功，被改造过的蛋白的蛋白质分子分子还是无法是无法遗传的。的。2 2对基因基因进展改造比展改造比对蛋白蛋白质直接改造要容直接改造要容易操作，易操作，难度要小得多。度要小得多。 二、蛋白质工程的根本原理1 1、蛋白、蛋白质工程的目的工程的目的 根据人根据人们对蛋白蛋白质功能的特定需求，功能的特定需求，对蛋白蛋白质的构造的构造进展分子展分子设计。2 2、天然蛋白、天然蛋白质的合成的合成过程程DNADNA基因基因转录转录mRNAmRNA翻译翻译蛋白质蛋白质基因基因表达表达转录和翻和翻译构成氨基酸序列的多构成氨基酸序列的多肽链构成具有高构成具有高级构造的蛋白构造的蛋白质行使生物功能行使生物功能中心法那么中心法那么centraldogman n生物的遗传信息从生物的遗传信息从 DNA DNA传送给传送给mRNAmRNA的过程的过程称为转录。根据称为转录。根据mRNAmRNA链上的遗传信息合成链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻译和表达。蛋白质的过程，被称为翻译和表达。19581958年年CrickCrick将生物遗传信息的这种传送方式称将生物遗传信息的这种传送方式称为中心法那么。为中心法那么。 复制：是亲代双链DNA按碱基配对原那么，准确构成两个一样核苷酸序列的子代DNA分子的过程。两条DNA链都可作为复制的模板。 转录：是以一条DNA链为模板，将DNA链上储存的遗传信息按碱基配对原那么准确转换成互补的mRNA的过程。 翻译：是以mRNA为模板，将mRNA上的遗传信息转换成蛋白质的氨基酸序列的过程。 中心法那么：遗传信息由DNA mRNA 蛋白质的流动途径。 蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA中心法那么：中心法那么：遗传信息信息由由DNA mRNA DNA mRNA 蛋白蛋白质的流的流动途径。途径。补充和完善之处：A：RNA作为遗传物质能自我复制，并作为mRNA指点PRO的合成。 B：RNA能以逆转录的方式将遗传信息传送给DNA分子。 、蛋白质工程的根本途径、蛋白质工程的根本途径预期的蛋白期的蛋白质功能功能设计预期的蛋白期的蛋白质构造构造推推测应有的氨基酸序列有的氨基酸序列找到相找到相对应的脱氧核苷酸序列基因的脱氧核苷酸序列基因讨论：某多：某多肽链的一段氨基酸序列是：的一段氨基酸序列是：丙氨酸丙氨酸色氨酸色氨酸赖氨酸氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸1 1怎怎样得出决得出决议这一段一段肽链的脱氧核苷酸序列？的脱氧核苷酸序列？请把相把相应的碱基序列写出来。的碱基序列写出来。首先首先应该根据三根据三联密密码子推出子推出mRNAmRNA序列，每种氨基序列，每种氨基酸都有酸都有对应的三的三联密密码子，只需子，只需查一下一下遗传密密码子子表，就可以将上述氨基酸序列的表，就可以将上述氨基酸序列的编码序列序列查出来。出来。再根据碱基互再根据碱基互补配配对规律推出脱氧核苷酸序列。但律推出脱氧核苷酸序列。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密密码子子编码，因此其碱基，因此其碱基陈列列组合起来就比合起来就比较复复杂，至少可以，至少可以陈列出列出1616种。种。密密码子：子：UCAUG A UUAmRNA密码子密码子密码子密码子密码子密码子mRNAmRNA上决上决议一个氨基酸的三个相一个氨基酸的三个相邻碱基碱基密密码子子总数：数：43=6443=64种种( (其中其中6161种密种密码子是子是对应氨基酸氨基酸 和起始；另有和起始；另有3 3个不个不对应氨基酸，只氨基酸，只对应终止止) )1 1种密种密码子只子只对应1 1种氨基酸；种氨基酸；1 1种氨基酸可以种氨基酸可以对应多种密多种密码子。子。 密密码子在生物界根本是是通用的。子在生物界根本是是通用的。这也是生物也是生物彼此彼此间存在存在亲缘关系的关系的证据之一据之一 。GCUGCU或或C C或或A A或或G GUGGAAAUGGAAA或或G GAUGUUUAUGUUU或或C C mRNAmRNA序列序列 脱氧核苷酸脱氧核苷酸序列序列GCT (GCT (或或C C或或A A或或G) TGGAAA (G) TGGAAA (或或G)ATGTTT (G)ATGTTT (或或C)C)CGA (CGA (或或G G或或T T或或C) ACCTTTC) ACCTTT或或C)TACAAA (C)TACAAA (或或G)G)2 2确定目的基因的碱基序列后，怎确定目的基因的碱基序列后，怎样才干才干合成或改造目的基因合成或改造目的基因DNADNA？确定目的基因的碱基序列后，就可以根据确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人人类的需求改造它，的需求改造它，经过人工合成的方法人工合成的方法或从基因或从基因库中中获取。取。蛋白质工程就是以蛋白质的构造与功能为根底，利用蛋白质工程就是以蛋白质的构造与功能为根底，利用基因工程的手段，按照人类本身的需求，定向地改造基因工程的手段，按照人类本身的需求，定向地改造天然的蛋白质，甚至发明新的、自然界本不存在的、天然的蛋白质，甚至发明新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。具有优良特性的蛋白质分子。u蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念19831983年，美国生物学家年，美国生物学家额尔默首先提出了默首先提出了“蛋白蛋白质工程工程的概念。蛋白的概念。蛋白质工程的工程的实际根据根据DNADNA指点合成蛋白指点合成蛋白质，因，因此，人此，人们可以根据需求可以根据需求对担任担任编码某种蛋白某种蛋白质的基因的基因进展重新展重新设计，使合成出来的蛋白，使合成出来的蛋白质的构造的构造变得符合人得符合人们的要求。的要求。蛋白质工程是指经过生物技术手段对蛋白质的分子蛋白质工程是指经过生物技术手段对蛋白质的分子构造或者对编码蛋白质的基因进展改造，以便获的更构造或者对编码蛋白质的基因进展改造，以便获的更适宜人类需求的蛋白质产品的技术。适宜人类需求的蛋白质产品的技术。蛋白质工程是指经过蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质工程是指经过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研讨，获取有关蛋白质物理和化学等各方面动力学的研讨，获取有关蛋白质物理和化学等各方面的信息，在此根底上利用生物技术手段对蛋白质的的信息，在此根底上利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进展有目的的改造并分别、纯化蛋白质，编码序列进展有目的的改造并分别、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业消费条件的全新蛋白质的过程。消费条件的全新蛋白质的过程。5 5、蛋白质工程与基因工程的关系、蛋白质工程与基因工程的关系 蛋白蛋白质工程是在基因工程的根底上，延工程是在基因工程的根底上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程合科技工程领域。域。 基因工程是基因工程是经过基因操作把外源基因基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中入适当的生物体内，并在其中进展表达，它展表达，它的的产品是品是该基因基因编码的天然存在的蛋白的天然存在的蛋白质。 蛋白质工程就是根据蛋白质的精细构造与功能之蛋白质工程就是根据蛋白质的精细构造与功能之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类本身的需间的关系，利用基因工程的手段，按照人类本身的需求，定向地改造天然的蛋白质，甚至发明新的、自然求，定向地改造天然的蛋白质，甚至发明新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。 蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可分。蛋白质工程根据对分子预先设计的方案，经过对分。蛋白质工程根据对分子预先设计的方案，经过对天然蛋白质的基因进展改造，来实现对它所编码的蛋天然蛋白质的基因进展改造，来实现对它所编码的蛋白质进展改造。因此，它的产品已不再是天然的蛋白白质进展改造。因此，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的、具有了人类所需求的优点的蛋质，而是经过改造的、具有了人类所需求的优点的蛋白质。白质。6、蛋白质工程与酶工程的关系n n绝大多数大多数酶都是蛋白都是蛋白质，酶工程与蛋白工程与蛋白质工程有什么区工程有什么区别？n n酶工程就是指将工程就是指将酶所具有的生物催化作所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，运用于消用，借助工程学的手段，运用于消费、生、生活、医活、医疗诊断和断和环境境维护等方面的一等方面的一门科科学技学技术。概括地。概括地说，酶工程是由工程是由酶制制剂的的消消费和运用两方面和运用两方面组成的。成的。酶工程的运用工程的运用主要集中于食品工主要集中于食品工业、轻工工业以及医以及医药工工业中。中。 通常所说的酶工程是用工程菌消费酶制剂，通常所说的酶工程是用工程菌消费酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子构造，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子构造，然后由酶的分子构造来确定相应基因的碱基序然后由酶的分子构造来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点那么在的合理充分利用，而蛋白质工程的重点那么在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的开展，其成果也会运用到酶工程蛋白质工程的开展，其成果也会运用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。 一、蛋白质的构造蛋白质分子的生物功能，与蛋白质分子的构造密不可分。决议蛋白质这种特殊生物功能的关键要素是它的分子构象。根本组成单位-氨基酸组成生物体蛋白质的20种氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸丙氨酸丙氨酸精氨酸精氨酸天冬天冬酰氨氨天冬氨酸天冬氨酸半胱氨酸半胱氨酸谷氨谷氨酰胺胺谷氨酸谷氨酸甘氨酸甘氨酸组氨酸氨酸异亮氨酸异亮氨酸亮氨酸亮氨酸赖氨酸氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸脯氨酸脯氨酸丝氨酸氨酸苏氨酸氨酸色氨酸色氨酸酪氨酸酪氨酸缬氨酸氨酸2.组成生物体蛋白质的20种氨基酸2氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸英文英文英文英文氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸英文英文英文英文赖赖组组脯脯脯脯苏苏丝丝色色色色天冬天冬天冬天冬精精精精LysLysHisHisProProThrThrSerSerTryTryAspAspArgArgLysineLysineHistidineHistidineProlineProlineThreonineThreonineSerineSerineTryptophanTryptophanAsparticacidAsparticacidArginineArginine谷谷谷谷缬缬半胱半胱半胱半胱丙丙丙丙亮亮亮亮酪酪酪酪甲硫甲硫甲硫甲硫( (蛋蛋蛋蛋) )GluGluValValCysCysAlaAlaLeuLeuTyrTyrMetMetGlutamicacidGlutamicacidValineValineCysteineCysteineAlanineAlanineLeucineLeucineTyrosineTyrosineMethionineMethionine甘甘甘甘苯丙苯丙苯丙苯丙GlyGlyPhePheGlycineGlycinePhenylalaninPhenylalanine e谷谷谷谷酰酰天冬天冬天冬天冬酰酰异亮异亮异亮异亮GlnGln AsnAsnIleIleGlutamineGlutamineAsparagineAsparagineIsoleucineIsoleucine 肽肽键与肽2) 肽键就是由氨基酸的就是由氨基酸的-羧基与相基与相邻的氨基酸的的氨基酸的-氨基脱水氨基脱水缩合而构成的合而构成的化学化学键肽肽键与肽3)肽肽: :氨基酸经过肽键连结起来的化合物氨基酸经过肽键连结起来的化合物二肽二肽: :两个氨基酸构成的肽两个氨基酸构成的肽三肽三肽: :三个氨基酸构成的肽三个氨基酸构成的肽多肽多肽: :许多氨基酸构成的肽许多氨基酸构成的肽蛋白质蛋白质: :大多为大多为100100个以上氨基酸组成的多肽个以上氨基酸组成的多肽氨基酸残基氨基酸残基: :多多肽链中不完全的氨基酸。中不完全的氨基酸。氨基酸由于构成氨基酸由于构成肽键而失去了一分子水，因而失去了一分子水，因此表此表现出其分子的不完好。出其分子的不完好。氨基末端：多氨基末端：多肽链中含有自在中含有自在-氨基的一氨基的一端。端。简称称N-N-端端羧基末端：多基末端：多肽链中含有自在中含有自在-羧基的一基的一端。端。 简称称C-C-端端蛋白质的一级构造蛋白质的一级构造蛋白质的一级构造是指氨基酸按蛋白质的一级构造是指氨基酸按一定的顺序经过肽键相连而成的一定的顺序经过肽键相连而成的多肽链，也是蛋白质最根本的构多肽链，也是蛋白质最根本的构造。造。每一种蛋白质分子都有本人特有每一种蛋白质分子都有本人特有的氨基酸的组成和陈列顺序即一的氨基酸的组成和陈列顺序即一级构造，由这种氨基酸陈列顺序级构造，由这种氨基酸陈列顺序决议它的特定的空间构造，也就决议它的特定的空间构造，也就是蛋白质的一级构造决议了蛋白是蛋白质的一级构造决议了蛋白质的二级、三级等高级构造质的二级、三级等高级构造。蛋白蛋白质分子的一分子的一级构造构造牛牛胰胰岛素素的的一一级构构造造1 11 1氢氢键键：氢氢原原子子与与负负电电性性强强的的原原子子如如氧氧、氮氮等等间间构构成成。对对蛋蛋白白质质分分子子三三维维构象的维护很重要。构象的维护很重要。2 2静静电电引引力力：正正负负带带电电基基团团之之间间的的吸吸引引力力。对对蛋蛋白白质质分分子子三三维维构构象象的的稳稳定定奉奉献献不是很大，也称为离子键或盐键不是很大，也称为离子键或盐键3 3范范德德华华力力：原原子子团团相相互互接接近近时时诱诱导导所所致致。它它变变化化多多样样，对对维维持持蛋蛋白白质质活活性性中中心的构象影响很大心的构象影响很大维持蛋白质空间构造的化学键维持蛋白质空间构造的化学键4 4疏疏水水相相互互作作用用：是是非非极极性性基基团团为为了了避避开开水水相相而而群群集集在在一一同同的的作作用用力力。疏疏水水作用是维持蛋白质高级构造的重要要素作用是维持蛋白质高级构造的重要要素5 5二二硫硫键键：作作用用很很强强，对对稳稳定定蛋蛋白白质质构象起重要作用构象起重要作用氢氢键键、离离子子键键、疏疏水水作作用用和和范范德德华华力力等等次级键是非共价键次级键是非共价键肽键、二硫键、酯键等被称之为共价键肽键、二硫键、酯键等被称之为共价键蛋白蛋白质二二级构造构造二二级构造是指多构造是指多肽链借助于借助于氢键沿一沿一维方向方向陈列成具有周期性构列成具有周期性构造的构象，是多造的构象，是多肽链部分的空部分的空间构造构象构造构象主要方式：主要方式：-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角、无角、无规卷曲等卷曲等-转转角角蛋白蛋白质分子的二分子的二级构造构造 螺旋螺旋折折叠片叠片转角角自在自在回回转三级构造三级构造三级构造是指整条多肽链在二级构造的根底上进一步三级构造是指整条多肽链在二级构造的根底上进一步盘曲而成特定格式的三级构造。盘曲而成特定格式的三级构造。四级构造四级构造很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立的、具有三很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立的、具有三级构造的多肽链组成的。级构造的多肽链组成的。这些多肽链之间只是经过疏水作用等次级键结合成为这些多肽链之间只是经过疏水作用等次级键结合成为有序陈列的特定的空间构造，构成了四级构造。有序陈列的特定的空间构造，构成了四级构造。在四级构造的蛋白质分子中，每个具有三级构造的多在四级构造的蛋白质分子中，每个具有三级构造的多肽链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，具有完好四肽链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，具有完好四级构造的蛋白质分子才有生物活性。级构造的蛋白质分子才有生物活性。血血红蛋白中四蛋白中四亚基两两一基两两一样，分分别称称为1 、2、1、2蛋白质工程主要包括蛋白质工程主要包括4大类研讨：大类研讨：第一，利用知的蛋白质一级构造的信息开发运用研第一，利用知的蛋白质一级构造的信息开发运用研讨。第二，定量确定蛋白质构造讨。第二，定量确定蛋白质构造-功能关系。这是目功能关系。这是目前蛋白质工程研讨的主体，它包括蛋白质三维构造前蛋白质工程研讨的主体，它包括蛋白质三维构造模型的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性模型的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研讨等研讨等.第三，从混杂变异体库中挑选具有特定构造第三，从混杂变异体库中挑选具有特定构造-功能关功能关系的蛋白质。系的蛋白质。第四，根据知构造第四，根据知构造-功能关系的蛋白质，用人工方法功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体合成它及其变异体.第二节蛋白质工程的根本步骤与改造战略一、一、蛋白蛋白质工程的根本步工程的根本步骤1分分别纯化目的蛋白，使之化目的蛋白，使之结晶晶,进展分析展分析,得到其空得到其空间构造的尽能构造的尽能够多的信息。多的信息。2对目的蛋白的功能作目的蛋白的功能作详尽的研尽的研讨，确定它，确定它的功能域。的功能域。3经过对蛋白蛋白质的一的一级构造、空构造、空间构造和功构造和功能之能之间的相互关系分析，找出关的相互关系分析，找出关键的基的基团和和构造。构造。(4)(4)围绕这些关些关键的基的基团和构造提出和构造提出对蛋蛋白白质进展改造的方案，并用基因工程的展改造的方案，并用基因工程的方法去方法去实施。施。(5)(5)对经过改造的蛋白改造的蛋白质进展功能性展功能性测定定. .二、蛋白质工程的改造战略二、蛋白质工程的改造战略1 1、疏水氨基酸、疏水氨基酸经常出如今蛋白常出如今蛋白质的活的活动中心区域；中心区域；螺旋和螺旋和折叠区通常不会是折叠区通常不会是酶的活性中心以及底物的活性中心以及底物结合的中心，而是作合的中心，而是作为构造的支架；构造的支架；环区、区、转角区域和角区域和带电荷区域通常位于蛋白荷区域通常位于蛋白质的外表。的外表。2 2、进展定点突展定点突变时，应留意保守氨基酸残基。假留意保守氨基酸残基。假设要要改改动酶活性、底物活性、底物结合活性等高度特异性的性合活性等高度特异性的性质，那，那么么应尽量保管保守残基。尽量保管保守残基。 3、应留意保管潜在的N糖基化位点(Asn-X-SerThr-X-Pro)中的Asn(天门冬酰胺)、Set(丝氨酸)或Thr(苏氨酸)。4、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，由于单个外显子通常编码独立折叠的构造域，删去该构造域后能够不会影响蛋白其他部分的正确折叠。5、构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接合部位处在具有一样或相近功能的氨基酸序列中；而当两个非同源蛋白组成嵌合体时，那么应使接合部分尽量位于所预测构造的边缘。66、假、假设对目的蛋白的三目的蛋白的三维构造一无所知，那么可以在构造一无所知，那么可以在目的序列中随机插入六聚体接目的序列中随机插入六聚体接头以以鉴定功能性构造域。定功能性构造域。插入六聚体接插入六聚体接头后，在原蛋白后，在原蛋白质序列中添加两个氨基酸，序列中添加两个氨基酸，比插入更多的氨基酸比插入更多的氨基酸对蛋白蛋白质整体功能的破坏要整体功能的破坏要轻。7 7、进展缺失突展缺失突变时，应防止直接利用天然存在的限制性防止直接利用天然存在的限制性酶切位点切位点进展展删除。除。 第三节、蛋白质改造方法在基因程度上对蛋白质进展改造，按改造的规在基因程度上对蛋白质进展改造，按改造的规模和程度可以分为：模和程度可以分为：初级改造：个别氨基酸的改动和一整段氨基酸初级改造：个别氨基酸的改动和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入序列的删除、置换或插入高级改造：蛋白质分子的剪裁，如构造域的拼高级改造：蛋白质分子的剪裁，如构造域的拼接接从头设计合成新型蛋白质从头设计合成新型蛋白质一、一、初初级改造改造经过基因突基因突变方法，以到达改方法，以到达改动氨基酸氨基酸进而改造而改造蛋白蛋白质的目的。的目的。目前，主要采用的基因突目前，主要采用的基因突变方法：方法：基因定位突基因定位突变盒式突盒式突变。基因定位突变基因定位突变根据三联体密码，编码根据三联体密码，编码DNADNA目的基因确实目的基因确实定位点，改动其组成核苷酸的顺序或种类，使定位点，改动其组成核苷酸的顺序或种类，使基因发生定向变异，使其控制合成的氨基酸种基因发生定向变异，使其控制合成的氨基酸种类、顺序发生改动，合成出具有预期氨基酸序类、顺序发生改动，合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。列的修饰蛋白质。这种经过呵斥一个或几个碱基定点突变，以这种经过呵斥一个或几个碱基定点突变，以到达修饰蛋白质分子构造目的的技术，称为基到达修饰蛋白质分子构造目的的技术，称为基因定点突变技术。因定点突变技术。基因定位突变的根本过程：基因定位突变的根本过程：首先使目的基来由环状载体折成单链，再对指定的首先使目的基来由环状载体折成单链，再对指定的位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生定位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统定位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统( (如大肠杆菌等如大肠杆菌等) )即可产生突变体蛋白质。这是目前定即可产生突变体蛋白质。这是目前定向改造蛋白质的根本手段。向改造蛋白质的根本手段。 一一M13-DNA寡聚核苷酸介寡聚核苷酸介导诱变技技术特点：可以准确按照人们的意图进展特点：可以准确按照人们的意图进展DNADNA突变，即想改突变，即想改动哪一个碱基就只改动哪一个，其他的不变动哪一个碱基就只改动哪一个，其他的不变根本过程：将待研讨的基因插入载体根本过程：将待研讨的基因插入载体M13M13，制得单链模，制得单链模板，人工合成一段寡核苷酸其中含一个或几个非配板，人工合成一段寡核苷酸其中含一个或几个非配对碱基作为引物，合成相应的互补链，用对碱基作为引物，合成相应的互补链，用T4T4衔接酶衔接酶衔接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在衔接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入适宜的表达系统合成突配碱基的就为突变型。再转入适宜的表达系统合成突变型蛋白质。变型蛋白质。二二寡核苷酸介寡核苷酸介导的的PCR诱变技技术 特点：利用特点：利用PCRPCR技术定点诱变，可使突变体大技术定点诱变，可使突变体大量扩增，提高诱变率量扩增，提高诱变率 以研讨基由于模板，用人工合成的寡核苷酸以研讨基由于模板，用人工合成的寡核苷酸含有一个或几个非互补的碱基为引物，直接含有一个或几个非互补的碱基为引物，直接进展基因扩增反响，就会产生突变型基因。分别进展基因扩增反响，就会产生突变型基因。分别出突变型基因后，在适宜的表达系统中合成突变出突变型基因后，在适宜的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。 过程：过程：将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各参与两个特定的中，每管各参与两个特定的PCRPCR引物，一个引物引物，一个引物与基因内部或其附近的一段序列完全互补，另一与基因内部或其附近的一段序列完全互补，另一引物和另一段序列互补，但有一个核苷酸发生了引物和另一段序列互补，但有一个核苷酸发生了突变；突变；两管中，不完全配对的引物与两条相反的链结合，两管中，不完全配对的引物与两条相反的链结合，即两个突变引物是互补的。由于两个反响中引物即两个突变引物是互补的。由于两个反响中引物的位置不同，所以的位置不同，所以PCRPCR扩增后，产物有不同的末扩增后，产物有不同的末端。端。将两管将两管PCRPCR产物混合、变性、复性，那么每条链产物混合、变性、复性，那么每条链会与另一管中的互补链退火，构成有两个切口的会与另一管中的互补链退火，构成有两个切口的环状环状DNADNA，转入大肠杆菌后，这两个切口均可被，转入大肠杆菌后，这两个切口均可被修复。假设同一管子中的两条修复。假设同一管子中的两条DNADNA链结合，会构链结合，会构成线性成线性DNADNA分子，它不能在大肠杆菌中稳定存在，分子，它不能在大肠杆菌中稳定存在，只需环状只需环状DNADNA才干在大肠杆菌中稳定存在，而绝才干在大肠杆菌中稳定存在，而绝大多数的环状分子都含有突变基因。大多数的环状分子都含有突变基因。 三随机诱变技术三随机诱变技术四盒式突变技术四盒式突变技术l常用方法：将基因克隆到常用方法：将基因克隆到质粒上，旁粒上，旁边有两个有两个严密相密相连的限制性内切的限制性内切酶位点，双位点，双酶解后解后产生一个生一个33凹陷的末端和一个凹陷的末端和一个55凹陷的末端，与克隆基因凹陷的末端，与克隆基因想想邻的末端是的末端是33凹陷和凹陷和55凹陷。凹陷。 l19851985年年WellsWells提出的一种基因修提出的一种基因修饰技技术，可，可经过一一次修次修饰，在一个位点上，在一个位点上产生生2020种不同氨基酸的突种不同氨基酸的突变体，从而可以体，从而可以对蛋白蛋白质分子中某些氨基酸分子中某些氨基酸进展展“饱和和性分析。性分析。 利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧呵斥两个原利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧呵斥两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链因，再用合成的发生不同变化的双链DNADNA片段替代被消片段替代被消化的部分。这样一次处置就可以得到多种突变型基因。化的部分。这样一次处置就可以得到多种突变型基因。 二、蛋白质分子的高级改造构造域的拼接二、蛋白质分子的高级改造构造域的拼接研研讨证明，在二明，在二级构造和三构造和三级构造之构造之间还有一个构有一个构造造层次，即构造域次，即构造域构造域由构造域由螺旋、螺旋、折叠等二折叠等二级构造构造单位按一定的位按一定的拓扑学拓扑学规那么构成的三那么构成的三维构造构造实体。体。构造域是蛋白构造域是蛋白质分子中一种根本的构造分子中一种根本的构造单位，构造位，构造域拼接是域拼接是经过基因操作把位于两种不同蛋白基因操作把位于两种不同蛋白质上的几上的几个构造域个构造域衔接在一同，构成交融蛋白，它兼有原来两接在一同，构成交融蛋白，它兼有原来两种蛋白的性种蛋白的性质。 三、全新蛋白质的设计与构建三、全新蛋白质的设计与构建上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个知顺序、上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个知顺序、构造和功能的蛋白质出发，根据一定的目的和设计方构造和功能的蛋白质出发，根据一定的目的和设计方案，运用多肽合成或者基因工程的方法，改动它的构案，运用多肽合成或者基因工程的方法，改动它的构造，以期到达改动其性质的目的。造，以期到达改动其性质的目的。假设要从头设计和构建一个自然界不存在的蛋白质，假设要从头设计和构建一个自然界不存在的蛋白质，那么需求借助多功能模板和蛋白质二级构造元件组装那么需求借助多功能模板和蛋白质二级构造元件组装成某种具有特定功能的人工蛋白质分子。成某种具有特定功能的人工蛋白质分子。 蛋白质工程在食品中的运用蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已获得蛋白质工程自问世以来，短短十几年的时间，已获得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的运用前景。良好的运用前景。 提高蛋白的提高蛋白的稳定性包括以下几个方面：定性包括以下几个方面：延伸延伸酶的半衰期；的半衰期；提高提高酶的的热稳定性；定性；延伸延伸药用蛋白的保管期；用蛋白的保管期；抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。失。一、一、消除消除酶的被抑制特性的被抑制特性19851985年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位突变技术，用突变技术，用1919种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第蛋白酶分子第222222位残基上易氧化的位残基上易氧化的MetMet，获得了一系，获得了一系列活性差别很大的突变酶。发现除了用列活性差别很大的突变酶。发现除了用CysCys替代替代MetMet的的突变体以外，其他突变体的酶活性都降低了。突变体以外，其他突变体的酶活性都降低了。 二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性溶菌酶分子：由一条肽链构成，并在空间上折叠构溶菌酶分子：由一条肽链构成，并在空间上折叠构成二个相对独立的构造域，酶活性中心位于二个构造成二个相对独立的构造域，酶活性中心位于二个构造域之间。该酶分子在第域之间。该酶分子在第9797位和位和5454位残基上是两个未构位残基上是两个未构成二硫键的半胱氨酸成二硫键的半胱氨酸由于二硫键是一种稳定蛋白质分子空间构造的重要由于二硫键是一种稳定蛋白质分子空间构造的重要共价化学键，有如建筑所用的钢筋一样，因此能将分共价化学键，有如建筑所用的钢筋一样，因此能将分子中的不同部位结实地结合在一同。因此，提高酶热子中的不同部位结实地结合在一同。因此，提高酶热稳定性最常用的方法是在分子中添加一对或数对二硫稳定性最常用的方法是在分子中添加一对或数对二硫键。键。 在高温下在高温下AsnAsn和和GlnGln容易脱氨构成容易脱氨构成AspAsp和和GluGlu，而导，而导致蛋白质分子构象的改动，使蛋白质失去活性。致蛋白质分子构象的改动，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进展诱变改造。这对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进展诱变改造。这种酶有两个一样的亚基，每个亚基含有种酶有两个一样的亚基，每个亚基含有2 2个个AsnAsn，由，由于它们都位于亚基之间的界面上，能够对酶的热稳于它们都位于亚基之间的界面上，能够对酶的热稳定性起决议性作用。定性起决议性作用。经过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第经过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第1414位和位和第第7878位上的位上的2 2个个AsnAsn分别转变成分别转变成Thr(Thr(苏氨酸苏氨酸) )和和Ile(Ile(异异亮氨酸亮氨酸) )残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。 三、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性三、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性四、四、改改动酶的最适的最适pH值条件条件葡萄糖异构葡萄糖异构酶最适最适pHpH为碱性，在碱性，在8080稳定，而在碱定，而在碱性条件下，性条件下， 80 80时使高果糖使高果糖浆焦化焦化产生有害物生有害物质，反，反响只能在响只能在6060进展。展。采用盒式突采用盒式突变技技术将葡萄糖异构将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基分子中酸性氨基酸酸(Glu(Glu或或Asp)Asp)集中的区域置集中的区域置换为碱性氨基酸碱性氨基酸(Arg(Arg或或Lys)Lys)，可使葡萄糖异构，可使葡萄糖异构酶的最适的最适pHpH值变为酸性，即可酸性，即可在高温下在高温下进展反响展反响五、提高酶的催化活性五、提高酶的催化活性酶的催化活性由酶分子上的必需基团决议酶的催化活性由酶分子上的必需基团决议如对酪氨酸如对酪氨酸-tRNA-tRNA合成酶进展定点突变合成酶进展定点突变在天然形状下，酪氨酸在天然形状下，酪氨酸-tRNA-tRNA合成酶分子内第合成酶分子内第5151位苏位苏氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环上的氧原子构成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与上的氧原子构成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与另一底物另一底物ATPATP的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶分子第分子第5151位苏氨酸残基改动为脯氨酸残基，酶位苏氨酸残基改动为脯氨酸残基，酶(Pro-(Pro-51)51)与与ATPATP的亲和力被添加了近的亲和力被添加了近100100倍，而且最大反响速倍，而且最大反响速度亦大幅度提高。度亦大幅度提高。 六、修六、修饰酶的催化特异性的催化特异性 利用定点突利用定点突变技技术葡萄糖淀粉葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活的催化特性。如将活性中心的性中心的GLuGLu、AspAsp被被GlnGln、AsnAsn取代取代时，突，突变体体酶分解分解-1-1，4 4糖苷糖苷键和和-1-1，4 4糖苷糖苷键的活性比例的活性比例发生明生明显改改动七、修饰七、修饰Nisin的生物防腐效应的生物防腐效应Nisin是乳酸球菌分泌的有较强抗菌作用的小分子肽，是乳酸球菌分泌的有较强抗菌作用的小分子肽，可用于罐头食品、乳制品、肉制品的保藏可用于罐头食品、乳制品、肉制品的保藏Nisin由由34个氨基酸残基构成个氨基酸残基构成改动改动NisinNisin氨基酸的序列，可加强其稳定性、溶解氨基酸的序列，可加强其稳定性、溶解度和扩展抑菌谱等，扩展度和扩展抑菌谱等，扩展NisinNisin的运用范围。的运用范围。 NisinNisin分子构造中包含分子构造中包含5 5种稀有氨基酸，即种稀有氨基酸，即ABAABA、DHADHA、DHBDHB、ALA-S-ALAALA-S-ALA和和ALA-S-ABAALA-S-ABA，它们经过硫醚键构成，它们经过硫醚键构成五个内环。五个内环。 蛋白质在风味修饰蛋白方面的运用n n1、物理改性、物理改性n n2、化学改性、化学改性n n1碱处置碱处置2酸处置酸处置n n3琥珀酰化作用琥珀酰化作用4乙酰化作用乙酰化作用n n5磷酸化作用磷酸化作用6酰胺化作用酰胺化作用n n7硫醇化作用硫醇化作用8酯化作用酯化作用n n9糖酰化作用糖酰化作用10去酰胺基作用去酰胺基作用n n3、酶法改性、酶法改性n n4、化学、化学-酶改性作用酶改性作用n n5、化学改性及酶法改性限制要素、化学改性及酶法改性限制要素n n如何消除苦味？如何消除苦味？思思考考题题1、什么是蛋白质工程、什么是蛋白质工程?蛋白质工程根本步骤有哪些蛋白质工程根本步骤有哪些?2、蛋白质的改性修饰技术有哪些、蛋白质的改性修饰技术有哪些?3、如何消除酶水解蛋白质的苦味？、如何消除酶水解蛋白质的苦味？