专题专题5 5 DNADNA和蛋白质技术和蛋白质技术湖南邵东三中湖南邵东三中 杨连进杨连进课题课题1 1DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 在在NaClNaCl溶液浓度低于溶液浓度低于0.14 mol/L0.14 mol/L时，时，DNADNA的溶解的溶解度随度随NaClNaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 0.14 mol/Lmol/L时，时，DNADNA溶解度最小；当溶解度最小；当NaClNaCl溶液浓度继续溶液浓度继续增加时，增加时，DNADNA的溶解度又逐渐增大。的溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol 2 molL L时，时，DNADNA的的溶解度最大，浓度为溶解度最大，浓度为 0 014 mol14 molL L时，时，DNADNA的溶的溶解度最低。利用这一原理，可以使解度最低。利用这一原理，可以使DNADNA在盐溶液在盐溶液中溶解或析出中溶解或析出如何通过控制如何通过控制NaClNaCl溶液的浓度使溶液的浓度使DNADNA在盐溶液中在盐溶液中溶解或析出？溶解或析出？DNADNA不不溶溶于于酒酒精精溶溶液液，但但是是细细胞胞中中的的某某些些物物质质则则可可以以溶溶于于酒酒精精。利利用用这这一一原原理理，可可以以将将DNADNA与蛋白质进一步分离与蛋白质进一步分离6 6、DNADNA在酒精溶液中的溶解性在酒精溶液中的溶解性7 7、DNADNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNADNA没有影响没有影响大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受60608080C C的高温，而的高温，而DNADNA在在8080C C以上才会变性以上才会变性洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质蛋白质, ,但对但对DNADNA没有影响没有影响8 8、DNADNA的鉴定的鉴定 DNA DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定二苯胺可以作为鉴定DNADNA的试剂的试剂 紫外灯照射法紫外灯照射法A A、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴化已锭（化已锭（EBEB）B B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴再滴一滴EBEB溶液染色溶液染色C C、将蜡纸放在紫外灯、将蜡纸放在紫外灯(260 nm)(260 nm)下照射（暗室中）下照射（暗室中），可见橙红色的荧光，可见橙红色的荧光(DNA(DNA的紫外吸收高峰在的紫外吸收高峰在260 260 nmnm处处) )甲基绿甲基绿 （蓝绿色）（蓝绿色）二、二、DNADNA的粗提取与鉴定的实验设计的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取 1 1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2 23 3种实验材料）种实验材料） 2 2、原则：凡是含有、原则：凡是含有DNADNA的生物材料都可以考的生物材料都可以考虑，但选用虑，但选用DNADNA含量相对较高的生物组织，成功含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大的可能性更大动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液1 1、动物细胞、动物细胞答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂破裂( (细胞膜和核膜的破裂细胞膜和核膜的破裂) )，从而释放出，从而释放出DNADNA讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜细胞膜2 2、植物细胞、植物细胞讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于有利于DNADNA的释放；食盐的主要成分是的释放；食盐的主要成分是NaClNaCl，有，有利于利于DNADNA的溶解的溶解实例：提取洋葱实例：提取洋葱DNADNA时，在切碎的洋葱中加入时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液过滤后收集研磨液答：研磨不充分会使细胞核内的答：研磨不充分会使细胞核内的DNADNA释放不完全，释放不完全，提取的提取的DNADNA量变少，影响实验结果，导致看不到量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？的影响？（三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质为了纯化提取的为了纯化提取的DNADNA需要将滤液作进一步处理需要将滤液作进一步处理讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？成分？答：可能含有核蛋白、多糖和答：可能含有核蛋白、多糖和RNARNA等杂质等杂质讨论：为什么反复地溶解与析出讨论：为什么反复地溶解与析出DNADNA，能够去，能够去除杂质除杂质答：用高盐浓度的溶液溶解答：用高盐浓度的溶液溶解DNADNA，能除去在高盐，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNADNA析出，能析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出溶解与析出DNADNA，就能够除去与，就能够除去与DNADNA溶解度不同的溶解度不同的多种杂质多种杂质讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的使提取的DNADNA与蛋白质分开；方案三利用的是与蛋白质分开；方案三利用的是DNADNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与质变性，与DNADNA分离。分离。（四）（四） DNADNA的析出与鉴定的析出与鉴定DNADNA的析出用的是与滤液体积相等的的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精冷却的酒精溶液（体积分数为溶液（体积分数为95 95 ） ，静置，静置2 23min3min，溶，溶液中会出现液中会出现白色丝状物，白色丝状物，这就是粗提取这就是粗提取DNADNA。用。用玻璃棒沿玻璃棒沿一个方向一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水纸吸取上面的水1 1、DNADNA的析出的析出2 2、 DNA DNA的鉴定的鉴定鉴定鉴定DNADNA时在试管中先加入物质的量的浓度为时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 2mol/L 的的NaClNaCl溶液溶液5ml5ml于两只试管中，其中一只于两只试管中，其中一只加入加入DNADNA丝状物，各加入丝状物，各加入二苯胺二苯胺4ml 4ml 试剂。混合试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热均匀后，将试管置于沸水中加热5min,5min,待试管冷待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有解有DNADNA的溶液是否有的溶液是否有蓝色蓝色（一）案例一：以鸡血为实验材料进行（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNADNA的粗的粗提取提取三、实验案例三、实验案例鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长较高，操作繁琐，历时较长1 1、鸡血细胞做实验材料的原因、鸡血细胞做实验材料的原因鸡血细胞核的鸡血细胞核的DNADNA含量丰富，材料易得含量丰富，材料易得2 2、实验原理、实验原理 DNA DNA在在NaClNaCl溶液中的溶解度，是随着溶液中的溶解度，是随着NaClNaCl的浓的浓度的变化而改变的。当度的变化而改变的。当NaClNaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为0.14 mol0.14 molL L时时,DNA,DNA的溶解度最低。利用这一原理，的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在可以使溶解在NaClNaCl溶液中的溶液中的DNADNA析出。析出。 DNA DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的步提取出含杂质较少的DNADNA。 DNA DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定二苯胺可以作为鉴定DNADNA的试剂。的试剂。3 3、实验材料和用具：、实验材料和用具：鸡血细胞液（鸡血细胞液（510ml510ml）；体积分数为）；体积分数为95%95%的冷酒的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h24h）；蒸馏水；）；蒸馏水；质量浓度为质量浓度为0 0g/mlg/ml的柠檬酸纳溶液；务质量的柠檬酸纳溶液；务质量的浓度分别为的浓度分别为2mol/L2mol/L和和0 0015mol/L015mol/L的氯化纳溶的氯化纳溶液；二苯胺试剂。铁架台；铁环；镊子；三角架；液；二苯胺试剂。铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（量筒（100ml100ml，一个）；烧杯；（，一个）；烧杯；（100ml100ml，一个，一个，50ml50ml、500ml500ml各二个）；试管（各二个）；试管（20ml20ml，二个）；，二个）；漏斗；试管夹；纱布。漏斗；试管夹；纱布。 4 4、课前准备鸡血细胞液、课前准备鸡血细胞液取质量浓度为取质量浓度为0 01g/ml1g/ml的的柠檬酸纳溶液（抗凝柠檬酸纳溶液（抗凝剂）剂）100ml100ml，置于，置于500ml500ml烧杯中。注入新鲜的鸡烧杯中。注入新鲜的鸡血（约血（约180ml180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min1000r/min（转每分）的离心机离心（转每分）的离心机离心2min2min，血细，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）过程过程柠檬酸钠作用柠檬酸钠作用防止血液凝固防止血液凝固作用机理作用机理柠檬酸钠能与血浆中的柠檬酸钠能与血浆中的CaCa2+2+发生反应，生成柠檬发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的酸钙络合物，血浆中游离的CaCa2+2+大大减少，血液大大减少，血液就不会凝固就不会凝固鸡血细胞破碎以后释放出的鸡血细胞破碎以后释放出的DNADNA，容易被玻璃容，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少器吸附，所以在提取过程中为了减少DNADNA的损失，的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液注意事项注意事项讨论：提取鸡血中的讨论：提取鸡血中的DNADNA时，为什么除去血液时，为什么除去血液中的上清液？中的上清液？答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆是血细胞，离心后除去的上清液是血浆5 5、方法步骤、方法步骤 将制备好的鸡血细胞液将制备好的鸡血细胞液5 mL5 mL10mL10mL，注入到，注入到50 50 mLmL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL20 mL，同时用，同时用玻璃棒玻璃棒充分搅拌充分搅拌5 min5 min，使血细胞加速破裂。使血细胞加速破裂。然然后，用放有后，用放有纱布的漏斗纱布的漏斗将血细胞液过滤至将血细胞液过滤至500mL500mL。取其滤液。取其滤液。提取鸡血细胞的细胞核物质提取鸡血细胞的细胞核物质讨论：讨论：答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破会吸水以至胀破（1 1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？会有什么变化？（2 2）用玻璃棒搅拌有什么意义？）用玻璃棒搅拌有什么意义？答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎太快太猛，防止打碎DNADNA（3 3）滤去的是什么物质？）滤去的是什么物质？得到的是什么？得到的是什么？答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNADNA溶解细胞核内的溶解细胞核内的DNADNA将氯化钠的物质的量浓度为将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol 2 mol的溶的溶40mL40mL加加入到滤液中，并用入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌玻璃棒沿一个方向搅拌1min1min，使其混合均匀，这时，使其混合均匀，这时DNADNA在溶液中呈溶解状态在溶液中呈溶解状态沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停玻璃棒不停地轻轻搅拌，地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于浓度相当于0.14 mol0.14 molL L）析出含析出含DNADNA的粘稠物的粘稠物讨论：加入蒸馏水的目的？讨论：加入蒸馏水的目的？降低降低NaClNaCl溶液浓度到使溶液浓度到使DNADNA溶解度最低点，使溶解度最低点，使DNADNA从从NaClNaCl溶液中析出溶液中析出将溶液中的将溶液中的DNADNA与其他杂质分离，这一步骤是实与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于利于DNADNA分子的附着和缠绕分子的附着和缠绕注意事项：注意事项：滤取含滤取含DNADNA的粘稠物的粘稠物用放有用放有多层纱布多层纱布的漏斗，过滤步骤的漏斗，过滤步骤3 3中的溶液中的溶液至至 500mL 500mL的烧杯中，含的烧杯中，含 DNA DNA的的粘稠物被留在纱粘稠物被留在纱布上布上将将DNADNA的粘稠物再溶解的粘稠物再溶解取取 1 1个个 50 mL 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为的量浓度为 2 mol 2 molL L的溶液的溶液 20mL 20mL。用钝头镊子。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择用玻璃择不停地搅拌，不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中过滤含有过滤含有DNADNA的氯化钠溶液的氯化钠溶液取取1 1个个100 mL100 mL烧杯，用放有烧杯，用放有两层纱布两层纱布的漏斗过的漏斗过滤步骤滤步骤5 5中的溶液。取其滤液，中的溶液。取其滤液，DNADNA溶于滤液溶于滤液中中提取含杂质较少的提取含杂质较少的DNADNA在上述滤过的溶液中，加入在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积冷却的、酒精的体积分数为分数为 95 95的溶液的溶液 50mL 50mL（使用冷却的酒精，对（使用冷却的酒精，对DNADNA的凝集效果较佳），并用的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，玻璃棒搅拌，溶液溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是的主要成分就是DNADNA答：因为答：因为DNADNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的解在酒精中，使含杂质较少的DNADNA丝状物可以析丝状物可以析出出, ,悬浮于溶液中悬浮于溶液中讨论：讨论：（2 2）观察丝状物呈什么颜色？）观察丝状物呈什么颜色？答：白色答：白色（1 1）为什么要加）为什么要加50mL50mL的冷酒精？的冷酒精？取两支取两支20 mL20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为浓度为0 0015 mol015 molL L的溶液的溶液5 mL5 mL，将丝状物放，将丝状物放入其中一支试管中，入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入解。然后，向两支试管中各加入4mlL4mlL的二苯胺试的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化颜色的变化 DNA DNA的鉴定的鉴定讨论：讨论：答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色原来颜色（2 2）这一鉴定结果说明什么问题？）这一鉴定结果说明什么问题？（1 1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是答：提取出的丝状物是DNADNA（3 3） DNA DNA的直径约为的直径约为202010-10 m10-10 m，实验中出现，实验中出现的丝状物的粗细是否表示的丝状物的粗细是否表示1 1个个DNADNA分子直径的大小分子直径的大小？答：答： DNA DNA分子直径只有分子直径只有2 nm2 nm。丝状物是多个。丝状物是多个DNADNA子聚在一起形成的子聚在一起形成的