蛋白质与DNA的相互作用 分类： 与单链RNA结合 与茎环构造结合 与双链DNA结合：普遍性结合 特异性结合蛋白质与DNA结合的特性：1.DNA识别部位有二度对称性。蛋白质普通是有二度对称构造的二聚体，两个单体具有旋转对称性，与硷基的旋转对称吻合。2.蛋白质和DNA的接触区只在DNA的一侧。3.在结合过程中，蛋白质和DNA都有构像改动。4.普遍性结合：蛋白质中带正电荷氨基酸与DNA骨架的磷酸基团构成离子键。5. 特异性结合：识别螺旋区内氨基酸与DNA特定硷基接触。蛋白质与DNA的普遍性结合中DNA特点： 蛋白质与DNA主链骨架接触，大多数涉及磷酸二酯键中的氧原子。 与DNA硷基序列特异性无关 构造的匹配性： 旋转对称性 特定间隔的相反电荷 构成氢键基团排布上的匹配 构成足够大的范德华力1.蛋白质和DNA都存在0.7nm 的反复间隔 DNA双螺旋单链相邻磷酸基团间的间隔是0.7nm。 折叠，N原子间间隔是0.7nm 伸展折叠C间间隔是0.7nm 螺旋，Arg和Lys被另外三个残基隔开，带正电荷侧链的间隔是0.7nm.2.DNA对称性 平移对称： GCATCT GCATCT CGTAGA CGTAGA 二重轴对称 GCATCT TCTACG CGTAGA AGATGC 二重旋转对称 GCATCT AGATGC CGTAGA TCTACG旋转对称 GCATCT CGTACA CGTAGA GCATGT 蛋白质与DNA特异性结合中DNA特点： 大沟内存在特异性识别信息 氨基酸与碱基对共平面 氨基酸和碱基对之间构成氢键 NNOHNNNHNNONHCOOCCNHHNHHHGluAgrH蛋白质与DNA普遍结合中蛋白质特点： -折叠构造的带正电荷残基与磷酸集团结合 能够是经过识别小沟构造实现 1.富含脯氨酸和碱性氨基酸 组蛋白有反复的SPKK Ser/Thr-Pro-Lys/ArgLys/Arg PRGRP序列与A-T碱基对结合 KPRGRPK序列也能与小沟A-T结合 2.碱性螺旋 组蛋白H1C端57个氨基酸 Lys和Gly,Lys在螺旋两侧，Gly夹在中间 3.蛋白磷酸化作用 SP X X： Ser磷酸化 TPKK： Tyr磷酸化 磷酸化后和DNA结合才干下降 磷酸化失去氢键蛋白质与DNA特异性结合中蛋白质特点： 1.蛋白质多构成二聚体HTH复合物同源盒构造亮氨酸拉链构造NH2COOH碱性氨基酸碱性氨基酸AgrAgr和和LysLys锌指构造Agr和G构成氢键细胞核蛋白质的提取 搜集细胞，洗去血清和培育基 裂解细胞：Triton X-100 NP-40 去胞浆成分 裂解细胞核：高浓度KCl :600mM 变卦缓冲液浓度快速抽提 裂解液： 提取液： 10mM HRPES 250mM Tris 1mM EDTA 60mM KCl 60mM KCl 1mM DTT 1mM DTT 1mM PMSF 1mM PMSF pH 7.9 0.5% NP-40 pH 7.9 1X107细胞100ul裂解液、冰浴5分钟、离心沉淀用不含NP-40的裂解液洗一次100ul提取缓冲液干冰异丙醇速冻，反复冻融3次离心沉淀 800C保管 凝胶滞后实验1.蛋白质和DNA结合复合物半衰期短 电泳缓冲液低离子强度 凝胶的笼效应2.探针以20-200bp 为宜。过小不利于蛋白结合，过大添加非特异性结合。3.用竞争性抑制检测DNA与蛋白质结合的特异性4.加3ug Poly(dI-dC)减少非特异性结合5.超级凝胶电泳加强蛋白质的凝胶阻滞作用6.只能确定结合，无法确定序列DNA脚印分析DNA脚印分析1.DNAase随机水解核苷酸磷酸二酯键 每一个DNA分子最好只切一次2.蛋白质与DNA结合维护DNA不被切割3.电泳用的是变性凝胶： 相差一个核苷酸DNA彼此分开 蛋白质从DNA分子上零落4.可确定与蛋白质结合的DNA序列5.DNA序列是固定的随机PCR凝胶阻滞实验：蛋白质和DNA结不结合， 不能确定结合的序列DNA脚印分析：蛋白质结合DNA的序列 不能确定序列硷基变化对 结合的影响随机PCR:结合序列硷基变化对结合的影响寡核苷酸设计与合成：1.AAGAATTCNNNNNNNNNGGATCCAA2. 引物合成3.规范结合反响寡核苷酸的合成4.电泳回收探针标志： 合成的含随机序列的单链寡核苷酸 3引物 32PdCTP dNTP(不包括dCTP) Klenow酶电泳纯化凝胶阻滞实验纯化探针1.蛋白质与规范结合寡核苷酸结合 蛋白质与随机寡核苷酸结合 电泳样品隔开，防污染2.凝胶回收3.酚、氯仿去蛋白4.PCR底物加32PdCTP5.PCR产物再做凝胶阻滞实验，反复纯化特异结合序列的克隆和序列分析： 酶切随机核苷酸序列与质粒重组 用引物对质粒序列进展分析 N1 N2 N3 N4 N5A 14/0.32 13/0.30 4/0.11 5/0.11 14/0.32C 9/0.21 12/0.27 23/0.52 26/0.59 7/0.16G 4/0.01 6/0.14 6/0.14 9/0.21 19/0.43T 17/0.39 13/0.30 11/0.25 4/0.01 4/0.01 T/A A/T/C C C G/A 超越50%：确定不可交换25-50%：两种硷基可交换小于25%：没有硷基特异性 SouthWestern杂交实验确定与DNA结合的蛋白质分子量 蛋白质进展SDS-Page 转移硝酸纤维素膜 与核酸探针杂交亲和层析纯化DNA结合蛋白凝胶阻滞检查DNA能否和蛋白质结合脚印法，测序确定DNA序列合成DNA制备亲和层析柱蛋白过亲和柱纯化 谢谢