人外周血淋巴细胞微核测定人外周血淋巴细胞微核测定 一、目的要求一、目的要求1、掌握人外周血淋巴细胞微核标本制备方法。2、熟悉人外周血淋巴细胞微核的形态特征。3、了解微核的发生机制及微核检测技术的用途。 二、实验原理二、实验原理: 人外周血淋巴细胞大都处于细胞周期的人外周血淋巴细胞大都处于细胞周期的G0期，期，在含有在含有PHA的培养基中进行体外培养后，原来处于的培养基中进行体外培养后，原来处于G0期的淋巴细胞可转化为淋巴母细胞，恢复分裂能期的淋巴细胞可转化为淋巴母细胞，恢复分裂能力。在细胞分裂过程中，由于化学物质或辐射作用力。在细胞分裂过程中，由于化学物质或辐射作用影响，可以引起淋巴母细胞染色体损伤，致使染色影响，可以引起淋巴母细胞染色体损伤，致使染色体断裂，无着丝粒的染色体断片不能随染色体移动体断裂，无着丝粒的染色体断片不能随染色体移动进入子细胞核，结果在细胞质中形成微核。本试验进入子细胞核，结果在细胞质中形成微核。本试验是一种体外测试有害因子遗传毒性的方法，通过在是一种体外测试有害因子遗传毒性的方法，通过在人类外周血淋巴细胞体外培养过程中加入受试物，人类外周血淋巴细胞体外培养过程中加入受试物，检测细胞微核情况来评价受试物的遗传毒性。同时检测细胞微核情况来评价受试物的遗传毒性。同时也成为检测致突变、致癌、致畸物质对机体遗传效也成为检测致突变、致癌、致畸物质对机体遗传效应的一种重要手段。应的一种重要手段。 三、实验用品三、实验用品（1）器材：离心管、注射器、培养瓶（）器材：离心管、注射器、培养瓶（10ml）、）、吸管、离心机、载玻片、冰箱、培养箱、恒温水吸管、离心机、载玻片、冰箱、培养箱、恒温水浴箱。浴箱。（2）试剂：）试剂：Giemsa染液、染液、pH6.8磷酸缓冲液、磷酸缓冲液、RPMI1640培养液、培养液、PHA溶液、溶液、0.075molL KCl溶液、甲醇溶液、甲醇:冰醋酸固定液冰醋酸固定液（3）材料：人外周血、环磷酰胺溶液。）材料：人外周血、环磷酰胺溶液。四、实验步骤四、实验步骤1、按人类外周血染色体培养常规方法采血、接种，按组分、按人类外周血染色体培养常规方法采血、接种，按组分别加入受试物（别加入受试物（CP终浓度终浓度100ug/ml）培养）培养72小时，收获前小时，收获前不用加秋水仙素，收获标本，离心，去上清液。不用加秋水仙素，收获标本，离心，去上清液。2、低渗：加入、低渗：加入0.075molL KCl溶液溶液4m1。混匀后放入。混匀后放入37恒温水浴箱中低渗处理恒温水浴箱中低渗处理10分钟。低渗时间可根据预实验分钟。低渗时间可根据预实验中细胞完整程度进行调整。中细胞完整程度进行调整。3、预固定：低渗结束后加入甲醇、预固定：低渗结束后加入甲醇冰乙酸（冰乙酸（3:1）固定液）固定液lml，混匀后离心（，混匀后离心（1000rpm）5分钟。分钟。4、固定：弃上清液，加入、固定：弃上清液，加入5ml固定液，混匀后离心固定液，混匀后离心（1000rpm）5分钟。弃上清液，留沉淀物。可按本方法再分钟。弃上清液，留沉淀物。可按本方法再固定一次。固定一次。5、滴片：加入少量固定液混匀成细胞悬液，滴片。、滴片：加入少量固定液混匀成细胞悬液，滴片。6、染色：用、染色：用Giemsa染液染色染液染色 10分钟。自来水细水冲洗后，分钟。自来水细水冲洗后，晾干。晾干。7、观察与计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细、观察与计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分散均匀，染色良好的区域，转到油镜下观察转胞分散均匀，染色良好的区域，转到油镜下观察转化的淋巴细胞，进行微核的观察和计数。化的淋巴细胞，进行微核的观察和计数。转化淋巴转化淋巴细胞细胞与与未转化淋巴细胞未转化淋巴细胞比较，前者细胞较大，胞核比较，前者细胞较大，胞核明显偏离中心，染色质较细致疏松或呈网状、核仁明显偏离中心，染色质较细致疏松或呈网状、核仁多，胞浆丰富，常见空泡和伪足。多，胞浆丰富，常见空泡和伪足。微核的识别：微核是存在于已转化的胞浆完整的淋微核的识别：微核是存在于已转化的胞浆完整的淋巴细胞中的小核，其直径为主核的巴细胞中的小核，其直径为主核的13以下，形态以下，形态为圆形或椭圆形，嗜色性和主核一致或略浅，为圆形或椭圆形，嗜色性和主核一致或略浅，必须必须与主核完全脱离与主核完全脱离。一个细胞中，不论出现一个微核。一个细胞中，不论出现一个微核或多个微核，均按一个有微核的细胞计数，微核细或多个微核，均按一个有微核的细胞计数，微核细胞率以千分率表示，即胞率以千分率表示，即1000个已转化的淋巴细胞个已转化的淋巴细胞中中有微核的细胞数。有微核的细胞数。作业:完成实验报告（实验目的、实验原理、实验用品、实验步骤、结果统计与分析）。学号观察细胞数观察细胞数观察具有微核的外周血淋巴细胞观察具有微核的外周血淋巴细胞数数总计微核千分率实验结果统计