三章节细胞生物学研究方法Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 光学显微镜技术光学显微镜技术（light microscopy） 电子显微镜技术电子显微镜技术 (Electron microscopy) 扫描遂道显微镜扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ）一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术 普通复式光学显微镜技术普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术荧光显微镜技术（FM） 激光共焦扫描显微镜技术激光共焦扫描显微镜技术（LCM） 相差相差显微镜（显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜微分干涉显微镜（DIM） 暗视野和倒置显微镜暗视野和倒置显微镜分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。光学显微镜的分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。光学显微镜的最小分辨率为最小分辨率为0.2um，电子显微镜的最小分辨率为电子显微镜的最小分辨率为0.2nm。（一）（一） 普通复式光学显微镜技术普通复式光学显微镜技术 组成：光学放大系统：目镜和物镜组成：光学放大系统：目镜和物镜 照明系统：光源、折光镜、聚光镜和滤光片照明系统：光源、折光镜、聚光镜和滤光片 机械和支架系统机械和支架系统性能参数：分辨率（区分开两支点间的最小距离）性能参数：分辨率（区分开两支点间的最小距离）（二）荧光显微镜技术（二）荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy）原理与应用原理与应用 荧光素直接标记技术荧光素直接标记技术 免疫荧光标记技术免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子 的定性定位研究：的定性定位研究： 如绿色荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)的应用的应用 （三） 激光共焦点扫描电镜技术 （laser scanning confocal microscopy）共焦点：共焦点：是指物镜和聚光镜聚焦在同一个点上。应用：应用：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7)，可重构样品的三维结构。（四）相差和微分干涉显微镜技术（四）相差和微分干涉显微镜技术原理：原理：光线通过不同密度的物质，滞留程度不同，密度大，滞留的时间长，否则时间短，从而产生光程差(相位差)，显微镜可以把这种光程差转换为振幅差。反差的产生：反差的产生：以样品种不同部位的密度差别为基础，产生通过光程差，通过物镜后面的差相板来夸大相位差，从而造成人眼可见的明暗区别。1. 相差显微镜相差显微镜（phasecontrast microscope）特点和应用：特点和应用：不需要染色，可观察活细胞、细胞核、线粒体等细胞器的动态。在医学和生物学方面应用广泛，如血液的观察，脓汁、分泌物的观察，细胞癌变得早期诊断，细胞的运动、细胞分裂现象的观察等。2. 微分干涉显微镜微分干涉显微镜(differentialinterference microscope） 采用的是平面偏振光，通过棱镜折射分成两束，分不同的时间经过样品的相邻部位，再通过棱镜的汇合，夸大厚度的差别，从而造成明暗区别。应用：应用：观察活细胞中较大的细胞器。A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM.a) under bright-fieldb) phase-contrastc) DIM倒置显微镜：倒置显微镜：由于物镜、聚光镜和光源的位置颠倒过来而得名。它的物镜和聚光镜之间的工作距离很长，能直接对培养皿中的培养细胞进行观察。还可与电视录像、相差物镜、电影摄影等装置相连。二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术（EM） 透射式电子显微镜（透射式电子显微镜（TEM） 扫描式电子显微镜（扫描式电子显微镜（SEM） 隧道式扫描电子显微镜（隧道式扫描电子显微镜（STM） 透射扫描电子显微镜（透射扫描电子显微镜（TSEM） 超高压透射扫描电子显微镜超高压透射扫描电子显微镜电子显微镜与光学显微镜光路图的比较电子显微镜与光学显微镜光路图的比较显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700） 紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电子显微镜与光学显微镜的比较电子显微镜与光学显微镜的比较基本构造：基本构造：（1）电子束照明系统：电子枪和聚光镜 （2）成像系统：物镜、中间镜和投影镜 （3）真空系统 （4）记录系统：荧光屏和感光胶片电镜制样技术电镜制样技术 超薄切片技术超薄切片技术 负染色技术负染色技术 冷冻断裂和冷冻蚀刻技术冷冻断裂和冷冻蚀刻技术三维重构技术三维重构技术喷镀技术喷镀技术1. 超薄切片技术超薄切片技术电子显微镜技术对样品的要求电子显微镜技术对样品的要求：（1）样品薄，一般是数十纳米）样品薄，一般是数十纳米 （2）保持样品的精细结构）保持样品的精细结构超薄切片技术样品的厚度为超薄切片技术样品的厚度为4050nm固定脱水包埋修块（粗修和细修）切片染色（醋酸铀、硝酸铀和铅）超薄切片技术的步骤路线超薄切片技术的步骤路线（1）戊二醛）戊二醛 1963年开始用作超薄切片的固定剂。作用原理：作用原理：醛基和蛋白质、磷脂中的氨基结合，把相邻的蛋白质交联起来，形成不可溶的网络。对于蛋白质、多糖和核酸的固定效果好，对脂类的差。优点：优点：分子量小，比较容易进入细胞，固定的标本可大些（小于12mm）。（2）甲醛）甲醛 是一种易挥发的还原剂，常用于光学显微镜的固定剂，在电子显微镜中，用磷酸缓冲液配制的甲醛溶液最为前固定剂。缺点：缺点：含有甲醇，容易使细胞的超微结构发生变化。（4）高锰酸钾）高锰酸钾 是一种强氧化剂，多用于细菌和组织培养技术。（3）饿酸）饿酸 是一种强氧化剂，可与氮结合。优点：优点：蛋白质、脂类的固定效果好，可与细胞的所有成分发生化学结合，产生电子反差，起“电子染色”的作用，不会使组织变硬、变脆，便于超薄切片。缺点：缺点：对糖类和核酸的保存差；分子较大，渗透力弱，使固定不均匀；固定时间不能久，否则脂蛋白复合体溶解，组织块发脆，造成切片困难；有毒，对呼吸道粘膜和眼角膜有固定作用；价格昂贵。超薄切片技术的应用：超薄切片技术的应用：除了单独应用于组织细胞的结构观察外，还可与放射性同位素自显影、细胞化学、免疫电镜和电镜原位杂交等技术结合，用于不同目的的研究。放射性同位素自显影：放射性同位素自显影：同位素引入（注射、饲喂、培养）制片（常规石蜡切片）涂乳胶（液体感光剂）曝光显影、定影染色、观察 又称阴性反差染色，由Hall（1955）和Huxley（1957）首先采用。负染法是将颗粒或者纤维样品分散在具有亲水性支持膜的载网上，然后滴加磷钨酸或醋酸双氧铀等染料，并随即吸去多于地染液，样品干燥后残余染料将沉积在样品的周围以及样品的凹陷、缝隙处，而样品本身呈浅色，所以称为负染。2. 负染色（负染色（negative staining）技术技术负染色技术步骤负染色技术步骤：样品分离与提纯制备悬浮液滴样染色观察Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens.Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b). 又称为冷冻蚀刻、冷冻断裂，是一种由冷冻断裂和复型相结合的样品制备技术。由Hall于1950年提出，1957年开始应用于生物样品的制备。操作步骤：操作步骤：迅速冷冻使样品固定、硬化 ，在真空中切断，使冰升华，暴露出断裂面的结构，再在切面上喷镀一层铂，碳投影，形成复型膜，在电镜下观察。优点优点： (1)能较好的保存生物大分子的天然特征 (2)可用于显示各类膜结构 (3)分辨力强，反差好(4)显示图象具有立体浮雕感(5)样品可长期保存。缺点：缺点：技术难度大，易产生冰晶损伤。 3. 冰冻蚀刻（冰冻蚀刻（freeze etching）技术技术喷镀技术：是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。5. 扫描电子显微镜技术（扫描电子显微镜技术（SEM）SEM：扫描电子显微镜STEM：扫描透射电子显微镜STM：扫描隧道显微镜AFM：原子力显微镜是在STM基础上的一种显微镜。X射线衍射技术：STM的主要装置包括实现的主要装置包括实现X、Y、Z三个方向扫三个方向扫描的压电陶瓷、逼近装置、电子学反馈控制描的压电陶瓷、逼近装置、电子学反馈控制系统和数据采集、处理显示系统。系统和数据采集、处理显示系统。STM的主要特点；的主要特点；1.具有原子尺度的高分辨率。具有原子尺度的高分辨率。侧分辨率侧分辨率0.1-0.2nm，纵分辨率纵分辨率0.001nm；2.可以在真空、大气、液体等多种条件下工作。可以在真空、大气、液体等多种条件下工作。3.非破坏性测量。与其功能相似的还有原子非破坏性测量。与其功能相似的还有原子力显微镜等十于种。力显微镜等十于种。第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物物1.离心分离技术离心分离技术（1）速度离心分离（差速离心、移动区）速度离心分离（差速离心、移动区带离心也称密度梯度离心）（带离心也称密度梯度离心）（2）等密度离心技术）等密度离心技术2.层析分离技术：层析是广泛应用分离蛋白质的方法，根层析分离技术：层析是广泛应用分离蛋白质的方法，根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。基本特点：有一个固定相和流动相。离方法。基本特点：有一个固定相和流动相。（1）凝胶过滤层析：又称排阻层析或分子筛法，根据蛋）凝胶过滤层析：又称排阻层析或分子筛法，根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。葡萄糖或琼脂糖。葡萄糖或琼脂糖。（2）离子交换层析：根据蛋白质所带电荷进行分离和纯）离子交换层析：根据蛋白质所带电荷进行分离和纯化。（化。（3）亲和层析：生物分子中的特定部位能够同其）亲和层析：生物分子中的特定部位能够同其他分子相互识别结合，如酶与底物、抗体与抗原的识他分子相互识别结合，如酶与底物、抗体与抗原的识别结合，结合是特异的、可逆的。别结合，结合是特异的、可逆的。二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养一、细胞培养1.动物细胞培养动物细胞培养（1）原代细胞：）原代细胞：1-10代从机体取出后立即培养的细胞。代从机体取出后立即培养的细胞。（2）继代细胞（传代细胞）继代细胞（传代细胞）-细胞株细胞株40-50代代（3）细胞系：无限分裂、无接触抑制的传代细胞。）细胞系：无限分裂、无接触抑制的传代细胞。分为两种基本形态：成纤维样细胞、上皮样细胞。可移动的游走分为两种基本形态：成纤维样细胞、上皮样细胞。可移动的游走细胞。细胞。2.植物细胞培养植物细胞培养（1）单倍体细胞培养）单倍体细胞培养（2）原生质体培养：植物体细胞用纤维素酶去壁的细胞称原生）原生质体培养：植物体细胞用纤维素酶去壁的细胞称原生质体。质体。第四节第四节 用于细胞生物学研究用于细胞生物学研究 的的 模式生物模式生物模式生物：具有个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快的特点常用的模式生物：病毒、细菌、黏菌、海胆、线虫、果蝇、斑马鱼小鼠等