流式细胞术原理及应用一、什么是流式细胞术？一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造流式细胞仪的构造二、怎样设计流式实验？二、怎样设计流式实验？三、流式实验中涉及到的关键三、流式实验中涉及到的关键步骤步骤四、常见流式细胞术应用四、常见流式细胞术应用一、流式细胞术基本概念流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选技术.研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等。对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量分析。流式细胞仪构造图流式细胞仪五大系统流动室与液流驱动系统流动室与液流驱动系统激光光源及光束成形系统激光光源及光束成形系统光学系统光学系统信号检测与分析系统信号检测与分析系统细胞分选系统细胞分选系统流动室与液流驱动系统Injector TipFluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeamSheath fluid流动室，430180um,鞘液1.空气加压进样2.蠕动泵精确定量进样激光光源与光束成形系统1.氩离子气体激光器，2266um2.固体激光器405nm, 488nm,561nm,635nm光学系统透镜、滤光片、小孔；LP：long-pass filter SP：short-pass filterBP：band-pass filter460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/50BP500/50信号检测与分析系统物理参数FSC：前向角散色光， 代表细胞大小SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度粒细胞粒细胞单核细胞单核细胞淋巴细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎红细胞、死细胞和碎片片实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。5%32%默认阈值升高阈值后荧光信号细胞自发荧光特异荧光素标记激发的荧光信号荧光信号的线性测量和对数测量-光电倍增管 1）检测光子，转换成电信号 2）将电信号等比例的放大荧光信号的面积、宽度和高度由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。线性测量：DNA含量、RNA含量、总蛋白含量对数测量：细胞膜表面抗原检测直方图（Distribution Histogram）横坐标：道数纵坐标：细胞数散点图（Dot Plot）横坐标：某细胞参数相对含量纵坐标：该细胞另一参数含量等高线图（Contour Plot）细胞分选系统MACS 技术技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学电荷式分选超声振动器(15-100kHz)液流充电系统高压偏转板收集装置(流式管、离心管、培养板、载波片等)二、荧光素荧光的概念： 激发波长Excitation wavelength发射波长(荧光波长)Emission wavelength激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光荧光素（FITC/PE/PerCP/APC等)抗体偶联荧光素；分子探针结合荧光素Annexin V-FITC；荧光染料/荧光化合物PI、7-AAD等插入核酸链中；CFSE和蛋白质共价结合；荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧光。常用荧光素常用荧光染料PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。三、如何设计流式实验确定实验要检测的marker选择合适的荧光素标记的抗体选择合适的同型对照抗体细胞处理（全血，培养的细胞）染色（室温，20min）离心洗涤（全血裂红）上机检测准备工作：实验步骤：A、根据机器配置选择荧光素 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。1)荧光素的选择：B、根据抗原表达强弱合理分配荧光素荧光素的强度：染色指数 Stain IndexStain Index = D/WCD4高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PEFSCSSCCD4 FITCSSCCD25 APCFoxp3 PE尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC/PE-Cy7；选择不同激光激发的荧光素，如FITC/APC，PE/APC；C、选择光谱重叠小的染料D、尽量避免偶联染料使用带来的假阳性0 hour2 hours22.5 hoursPECD3 PE-Cy5CD3 PE-Cy5CD8 PE-Cy7CD8 PE-Cy7样本曝光时间3）流式试验对照设置A、空白对照 Negative Control细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越大，电子信号越强；电压越小，信号越弱。通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。001001002同型对照抗体：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型（Fc段相同，F（ab）2段不同）与染色的单克隆抗体：相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型相同荧光素标记 相同剂量和浓度但由未免疫动物血清纯化而来用此消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体而产生的背景染色B、同型对照 Isotype ControlC、阳性对照 Positive Control设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效，并不是每次分析时都必须设置：使用新的荧光素抗体时；使用存储时间较长的荧光素抗体时。设置阳性对照的方法：用肯定表达有该抗原的细胞来检测；已经证明有效的、偶联其他荧光素的该抗原的抗体。什么是荧光补偿？纠正荧光素发射光谱重叠为什么要进行补偿调节？520400500600700575665FITCFITC PEPEPC5PC5laserlaserD、 单标对照 Single Staining Control补偿调节方法：FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2 - %FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1 - %FL2BeforeCompensationAfter CompensationFITC 单标PE 单标什么样的补偿最合适？单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median值相等时为最合适的补偿。UncompensatedCompensatedFL1-FITC stainFL2-no stainFL1-FITC stainPE-Medianneg PE-MedianposFL1-FITC stainOvercompensated准确补偿的重要性补偿调节要合适未补偿未补偿正确补偿正确补偿FITC-PE补偿太大补偿太大PE-FITC补偿太大补偿太大 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别染色 n色分析就要制备n 个补偿对照管举例：双染实验设门与数据分析门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。流式结果十字门十字门线性门线性门黏附因子黏附因子表面受体表面受体细胞因子胞因子分泌到胞外分泌到胞外的的细胞因子胞因子胞内抗原胞内抗原核酸含量核酸含量核内抗原核内抗原细胞功能细胞表面、胞浆、核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性细胞受体细胞内钙离子流式细胞仪检测范围=HIV免疫分型，免疫分型，CD4绝对计数绝对计数=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=肿瘤的细胞周期和倍体分析肿瘤的细胞周期和倍体分析=网织红细胞计数网织红细胞计数=细胞移植的交叉配型和免疫状态监测细胞移植的交叉配型和免疫状态监测=干细胞计数干细胞计数=残量白血病细胞检查残量白血病细胞检查=HLA-B27检查检查=血小板功能及相关疾病血小板功能及相关疾病医学应用科研应用在免疫学研究中的应用在免疫学研究中的应用: : 鉴定免疫细胞类型抗原特异性T细胞研究细胞因子分泌细胞研究全血细胞研究凋亡检测细胞增殖检测干细胞向免疫细胞分化的研究转染荧光蛋白细胞系研究稀有细胞检测。 在神经生物学研究中的应用：在神经生物学研究中的应用： 神经干细胞和神经祖细胞的特性研究； 不同类型的神经细胞的鉴定和功能研究；星形胶质细胞和胶质细胞的鉴定和功能研究；检测细胞活性，细胞凋亡和细胞周期；神经细胞发育过程研究干细胞向神经细胞分化研究。在肿瘤研究中的应用：在肿瘤研究中的应用：细胞凋亡的检测；细胞周期分析；细胞增殖研究；荧光蛋白分析；肿瘤干细胞的鉴定和功能分析；循环肿瘤细胞的鉴定和功能分析；实体瘤细胞的检测分析（肿瘤组织解离成单细胞后）；肿瘤细胞系表型分析；细胞活性的检测；。在细胞生物学和分子生物学研在细胞生物学和分子生物学研究中的应用：究中的应用：检测细胞转染效率；检测转导效率；分析细胞中荧光蛋白的表达；分析蛋白蛋白之间的相互作用（FRET）分析细胞活性，细胞凋亡，和细胞周期；研究细胞的分化过程；研究细胞增殖；。在高通量检测和新药研发中的在高通量检测和新药研发中的应用：应用：细胞功能变化的研究；细胞周期和活性；细胞凋亡；细胞增殖；新药研发；培养基研发；。海洋生物学海洋生物学富集和分析细菌，藻类，浮游植物等微生物学微生物学细菌和酵母检测；荧光蛋白检测。生物燃料生物燃料 Bodipy和/或 Nile Red中脂类的定量藻类，蓝藻细菌，酵母和细菌等生物的富集4.1 细胞周期检测处于不同细胞周期的细胞DNA含量不同，G0/G1期细胞含有二倍体量的DNA，G2/M期细胞含有四倍体量的DNA，而S期细胞DNA含量处于二倍体和四倍体量之间。DNA荧光染料能与DNA结合，DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度反应了DNA吸收荧光分子的多少。通过流式检测就能反映细胞内DNA的含量，区分细胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例。四、常见流式细胞术应用细胞周期分析核酸染料细胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不能进入完整细胞膜，标记时需要通过固定等方法增加细胞膜的通透性。细胞膜通透性染料：Hoechst、DPAI等能染活细胞的DNA，但需紫外激光激发。PI标记法检测细胞周期需要乙醇固定增加细胞膜的通透性；需要加RNase，去除RNA对DNA的干扰。PI法检测细胞周期一般步骤：收集单细胞悬液(1 106个)，缓慢加入1 ml预冷的70乙醇，于4固定过夜，或-20长期固定。离心收集细胞，再以1ml PBS彻底洗去乙醇；去上清后加入染色液(包含50ug/ml PI，100ug/ml RNase A，0.2% Triton X-100)，37 染色30min后上机检测。细胞周期检测结果通过流式检测，能得出G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例。增殖指数(proliferous index, PI)：指处于S期和G2/M期细胞之和占总细胞的比例，反映了细胞的增殖能力。CV值(变异系数)：衡量仪器测量分辨率和精度的指标。脾脏细胞脾脏细胞培养肿瘤细胞培养肿瘤细胞DNA倍体检测病变肿瘤细胞常出现结构和染色体异常，流式检测DNA含量能反映异倍体情况。DNA指数(DNA index, DI)：(样本的G0/G1期峰平均荧光道数)/(正常二倍体细胞G0/G1期峰平均荧光道数)。倍体(ploidy)：染色体数目。二倍体 DI=1；四倍体 DI=2；二倍体四倍体之外统称异倍体。二倍体二倍体四倍体四倍体异倍体异倍体小鼠精子单倍体细胞小鼠精子单倍体细胞亚二倍体(Sub-G1)峰的检测 凋亡细胞核小体崩解，DNA含量减少，加之由于DNA的降解，与荧光染料的结合减少，因此DNA染料的着色能力下降，荧光强度降低，表现在G1峰前出现亚二倍体峰，即亚G1峰(凋亡峰)。细胞凋亡峰细胞凋亡峰 Sub-G1四倍体峰四倍体峰二倍体峰二倍体峰PINumber4.2 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡正常细胞膜是不对称性的，胞浆面含有带负电的磷脂(如磷脂酰丝氨酸, PS)。早期凋亡时，细胞表面不对称性发生改变，PS外翻到胞外侧Annexin V是一种Ca2+依赖性的对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别膜表面是否有PS，从而识别凋亡细胞。PI常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所以PI不能进入早期凋亡细胞核内。Annexin V-FITCAnnexin V-FITCP PI I活细胞活细胞早期凋亡早期凋亡晚期凋亡晚期凋亡坏死细胞坏死细胞裸核裸核免疫荧光图免疫荧光图ALA光敏剂(1mM/M)HL60 氦氖激光(18mj/cm2)C1h2h3h4h5h4.3 淋巴细胞亚群分析GranulocytesGranulocytesMonocytesMonocytesEosinophilsEosinophilsBasophilsBasophilsNeutrophilsNeutrophilsLymphocytesLymphocytesT TB BNKNKPeripheral White Blood CellsPeripheral White Blood CellsCD45CD45+ +T T HelperHelperCD3CD3+ +CD4CD4+ +T TCytotoxicCytotoxicCD3CD3+ +CD8CD8+ +CD3CD3+ +CD3CD3- -CD19CD19+ +CD3CD3- -CD16CD16+ +CD56CD56+ +MonocytesMonocytesCD14CD14+ +淋巴细胞亚群分析根据功能，淋巴细胞主要分为：T淋巴细胞(CD3+)，与细胞免疫有关；辅助性T细胞 (CD3+CD4+)：helper T cells，Th细胞；细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)：Cytotoxic T cells，Tc细胞。B淋巴细胞(CD19+)，与体液免疫有关；NK细胞(CD3-CD16+CD56+)，行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。总T、总B和NK细胞的比例以及Th/Tc可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。FSCSSCCD3 PerCPSSCCD4 FITCCD8 PE42.04%48.3%1.8%13.9%35.9%T淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析CD3 PerCPCD4 FITCCD8 PE42.82%37.41%49.68%T细胞、细胞、B细胞和细胞和NK细胞比例检测细胞比例检测亚群亚群百分比百分比()绝对计数绝对计数(个个/ul)总T细胞(CD3+)50-84955-2860总B细胞(CD3-CD19+)5-1890-560NK细胞(CD3+/CD16+CD56+)7-40150-1100健康成年人外周血淋巴细胞参考范围健康成年人外周血淋巴细胞参考范围Thank You