第二章第二章 谷氨酸发酵机制谷氨酸发酵机制 第一节第一节 谷氨酸发酵机制谷氨酸发酵机制1.谷氨酸的作用：谷氨酸谷氨酸的作用：谷氨酸(g1utamate，Glu，C5H9O4N)是中枢神经系统中一种最重要的是中枢神经系统中一种最重要的兴奋性神兴奋性神经递质经递质，主要分布于大脑皮质、海马、小脑和纹状，主要分布于大脑皮质、海马、小脑和纹状体，在体，在学习学习、记忆记忆、神经元可塑性神经元可塑性及及大脑发育大脑发育等方等方面均起重要作用。此外，谷氨酸对面均起重要作用。此外，谷氨酸对心肌能量代谢心肌能量代谢和和心肌保护心肌保护起着重要作用。起着重要作用。 一、谷氨酸生物合成途径一、谷氨酸生物合成途径 生物体内合成谷氨酸的前体物质是生物体内合成谷氨酸的前体物质是a酮戊二酸酮戊二酸，是三羧酸循环是三羧酸循环(TCA循环循环)的中间产物，由糖质原料生的中间产物，由糖质原料生物合成谷氨酸的途径包括物合成谷氨酸的途径包括糖酵解途径糖酵解途径(EMP途径途径)、三三羧酸循环羧酸循环、乙醛酸循环乙醛酸循环、CO2的固定反应的固定反应(伍德一沃伍德一沃克曼反应克曼反应)等。等。（一）、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循环（一）、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循环和乙醛酸循环和乙醛酸循环 1.糖酵解途径（糖酵解途径（EMP途径）途径）将将一分子葡萄糖一分子葡萄糖分解成分解成两分子丙酮酸两分子丙酮酸,并且发生并且发生氧化氧化(脱氢脱氢)和生成少量和生成少量ATP。 葡萄糖葡萄糖6磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖3磷酸甘油醛磷酸甘油醛丙酮酸丙酮酸6磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸5磷酸核酮糖磷酸核酮糖HMP途径EMP途径2.戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（HMP途径）途径）可以生成酵解途径的中间产物可以生成酵解途径的中间产物6磷酸果糖磷酸果糖和和3磷酸甘油醛磷酸甘油醛。肌肉中的葡萄糖代谢情况肌肉中的葡萄糖代谢情况3.三羧酸循环（三羧酸循环（TCA循环）循环）谷氨酸谷氨酸（胞内）（胞内）转移到转移到胞外胞外草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸异柠檬酸异柠檬酸- -酮戊二酸酮戊二酸琥珀酸琥珀酸延胡索酸延胡索酸苹果酸苹果酸丙酮酸丙酮酸乙酰乙酰CoA乙醛酸乙醛酸+CO2乙醛酸循环中的两个乙醛酸循环中的两个关键关键酶酶异柠檬酸裂解酶异柠檬酸裂解酶和和苹果酸合成酶。苹果酸合成酶。 异柠檬酸脱氢酶 NH4酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶 （二）谷氨酸合成的理想途径（二）谷氨酸合成的理想途径在发酵在发酵产酸产酸期，期，EMP所占比例更大，约为所占比例更大，约为74。 生物素充足菌生物素充足菌EMP所占比例约为所占比例约为62； （三）由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径（三）由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径 3.在谷氨酸发酵的在谷氨酸发酵的菌体生长期菌体生长期，由于三羧酸循环中，由于三羧酸循环中的的缺陷缺陷(丧失丧失a酮戊二酸脱氢酶氧化能力或氧化能力酮戊二酸脱氢酶氧化能力或氧化能力微弱微弱)，谷氨酸产生菌采用，谷氨酸产生菌采用乙醛酸循环乙醛酸循环途径进行代谢，途径进行代谢，提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等。提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等。2.此代谢途径至少有此代谢途径至少有16步酶步酶促反应。促反应。1.谷氨酸生产菌株为谷氨酸生产菌株为缺陷型缺陷型，生产过程分为，生产过程分为菌体生菌体生长期长期和和谷氨酸积累期谷氨酸积累期。 4. 在菌体生长期之后，进入在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期谷氨酸生成期，封闭封闭乙醛酸循环，乙醛酸循环，积累积累- -酮戊二酸酮戊二酸，就能够大量生就能够大量生成、成、积累谷氨酸积累谷氨酸。 因此在谷氨酸发酵中，菌体生长期的最适条因此在谷氨酸发酵中，菌体生长期的最适条件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的。件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的。 5. 由葡萄糖生由葡萄糖生物合成谷氨酸的物合成谷氨酸的代谢途径代谢途径 （1 1）在谷氨酸生成期，）在谷氨酸生成期，假如四碳二假如四碳二羧羧酸是酸是100100通通过过C0C02 2固定反固定反应应供供给给，在生在生长长期之后，理想期之后，理想的的发发酵按如下反酵按如下反应进应进行：行：1mol1mol葡萄糖可以生成葡萄糖可以生成1mol1mol的谷氨酸，谷氨酸的谷氨酸，谷氨酸对对葡萄葡萄糖的糖的质质量理量理论转论转化率化率为为：6.葡萄糖对谷氨酸的转化率葡萄糖对谷氨酸的转化率（2 2）在谷氨酸生成期，若）在谷氨酸生成期，若 COCO2 2固定反固定反应应完全不起作用完全不起作用，丙丙酮酮酸在丙酸在丙酮酮酸脱酸脱氢氢酶酶的催的催化作用下，脱化作用下，脱氢氢脱脱羧羧全部氧全部氧化成乙化成乙酰酰CoACoA，通，通过过乙乙醛醛酸酸循循环环供供给给四碳二四碳二羧羧酸。反酸。反应应如下：如下：3C6H12O66丙酮酸丙酮酸6乙酰乙酰CoA乙醛酸循环：乙醛酸循环：4乙酰乙酰CoA +4H2O2琥珀酸琥珀酸+4CoASH6乙酰乙酰CoA +2NH3+3O22谷氨酸谷氨酸+2CO2+6H2O3mol葡萄糖可以生成葡萄糖可以生成2mol的谷氨酸，谷氨的谷氨酸，谷氨酸对葡萄糖的酸对葡萄糖的质量理论转化率质量理论转化率为：为：(3)实际转化率：实际转化率：处于二者之间，处于二者之间，即即54.4%81.7%。CO2固定反应、乙醛酸循环的比率等对转化率影固定反应、乙醛酸循环的比率等对转化率影响较大。响较大。乙醛酸循环活性越高，谷氨酸越不易生成与积累。乙醛酸循环活性越高，谷氨酸越不易生成与积累。 7.醋酸醋酸或或正石蜡正石蜡原料发酵谷氨酸的推测途径原料发酵谷氨酸的推测途径 在醋酸发酵谷氨酸或石油发酵谷氨酸时，却在醋酸发酵谷氨酸或石油发酵谷氨酸时，却只能只能经乙醛酸循环供给四碳二羧酸经乙醛酸循环供给四碳二羧酸，四碳二羧酸经草酰，四碳二羧酸经草酰乙酸又转化为柠檬酸。乙酸又转化为柠檬酸。二、谷氨酸生物合成的代谢调节机制二、谷氨酸生物合成的代谢调节机制 在工业上，通过在工业上，通过对微生物代谢途径的控制对微生物代谢途径的控制来满足来满足生产的需要，提高生产效益。生产的需要，提高生产效益。所以，研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。所以，研究微生物代谢调节机制有极其重要的意义。 合成代谢将分解代谢产生的能量和合成代谢将分解代谢产生的能量和中间体合成氨基酸、核酸、蛋白质中间体合成氨基酸、核酸、蛋白质等物质。等物质。微生物微生物的代谢的代谢分解代谢分解代谢：合成代谢合成代谢：从环境中摄取营养物质，把它们转从环境中摄取营养物质，把它们转化为自身物质，以此来提供能源和化为自身物质，以此来提供能源和小分子中间体；小分子中间体； 1糖代谢糖代谢(EMP途径和途径和HMP途径途径)的调节的调节 糖代谢可分为糖代谢可分为分解分解与与合成合成两方面。两方面。糖分解代谢糖分解代谢包括酵解与三羧酸循环；包括酵解与三羧酸循环；（提供能量）（提供能量）合成代谢合成代谢包括糖的异生、糖原与结构多糖的合成等，包括糖的异生、糖原与结构多糖的合成等，中间代谢还有磷酸戊糖途径、糖醛酸途径等。中间代谢还有磷酸戊糖途径、糖醛酸途径等。（消（消耗能量）耗能量） (1)能荷的调节能荷的调节腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷(腺苷三磷酸腺苷三磷酸)，简称为，简称为ATP。 其其结构简式是：结构简式是：APPP，其相邻的两个磷酸，其相邻的两个磷酸基之间的化学键非常活跃，基之间的化学键非常活跃，水解时可释放约水解时可释放约30.54kJ/mol的能量，的能量，因此称为高能磷酸键。因此称为高能磷酸键。能荷调节是通过能荷调节是通过ATP、ADP和和AMP分子对某些酶分子对某些酶分子进行变构调节来实现的。分子进行变构调节来实现的。Atkinson提出了能荷的概念。提出了能荷的概念。认为认为能荷能荷是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量，是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量，能荷大小可以说明生物体中能荷大小可以说明生物体中ATPADPAMP系统的系统的能量状态。能荷的大小决定于能量状态。能荷的大小决定于ATP和和ADP的多少。的多少。 能荷逐渐升高时，能荷逐渐升高时，即细胞内的能量水平逐渐升高，即细胞内的能量水平逐渐升高，这一过程中这一过程中AMP、ADP转变成转变成ATP。 ATP的增加会的增加会抑制糖分解代谢，抑制糖分解代谢，抑制如柠檬酸合抑制如柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等酶的活性，并激活糖类合成酶、异柠檬酸脱氢酶等酶的活性，并激活糖类合成的酶，加速糖原的合成。成的酶，加速糖原的合成。 糖酵解糖酵解主要受三个酶调节：磷酸果糖激酶、己糖激酶、主要受三个酶调节：磷酸果糖激酶、己糖激酶、丙酮酸激酶，其中丙酮酸激酶，其中磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶是限速酶，己糖激酶控制酵是限速酶，己糖激酶控制酵解的入口，丙酮酸激酶控制出口；解的入口，丙酮酸激酶控制出口；三羧酸循环三羧酸循环的调控由三个的调控由三个酶调控，即酶调控，即柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶和和酮戊二酸脱酮戊二酸脱氢酶氢酶。两者都与能荷的控制调节相关。两者都与能荷的控制调节相关。 当生物体内生物合成或其它需能反应加强时，细胞当生物体内生物合成或其它需能反应加强时，细胞内内ATP分解生成分解生成ADP或或AMP，ATP减少，减少，能荷降低能荷降低，就会就会激活激活某些催化糖类分解的酶某些催化糖类分解的酶(糖原磷酸化酶、磷酸糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等)或解除或解除ATP对这些酶的抑制，并抑制合成糖原的酶对这些酶的抑制，并抑制合成糖原的酶(NN合成酶、合成酶、果糖果糖1，6二磷酸酯酶等二磷酸酯酶等)，从而加速酵解、，从而加速酵解、TCA循循环产生能量，通过氧化磷酸化作用生成环产生能量，通过氧化磷酸化作用生成ATP。 (2)生物素对糖代谢速率的调节生物素对糖代谢速率的调节 生物素对糖代谢的调生物素对糖代谢的调节与能荷的调节是不同的，节与能荷的调节是不同的，能荷是对糖代谢流的调节，能荷是对糖代谢流的调节，而而生物素能够促进糖的生物素能够促进糖的EMP、HMP途径、途径、TCA循环。循环。 谷氨酸产生菌大多为谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型生物素缺陷型。许多研究表。许多研究表明，生物素对从糖开始到丙酮酸为止的糖降解途径的明，生物素对从糖开始到丙酮酸为止的糖降解途径的比例并没有显著的影响，主要作用是比例并没有显著的影响，主要作用是对糖降解速率的对糖降解速率的调节。调节。 原因：原因：碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢中的碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢中的许多反应都需要生许多反应都需要生物素物素。 生物素的主要功能生物素的主要功能是在脱羧是在脱羧羧化反应和脱氨反应中起羧化反应和脱氨反应中起辅酶辅酶作用，并和碳水化合物与蛋白质的互变、碳水化合物以及蛋白作用，并和碳水化合物与蛋白质的互变、碳水化合物以及蛋白质向脂肪的转化有关。质向脂肪的转化有关。 在碳水化合物代谢中，生物素酶能催化脱羧和羧化反应。碳在碳水化合物代谢中，生物素酶能催化脱羧和羧化反应。碳水化合物代谢中依赖生物素的特异反应有：丙酮酸转化生成草水化合物代谢中依赖生物素的特异反应有：丙酮酸转化生成草酰乙酸；苹果酸转化为丙酮酸；琥珀酸与丙酮酸的互变；草酰酰乙酸；苹果酸转化为丙酮酸；琥珀酸与丙酮酸的互变；草酰琥珀酸转化为琥珀酸转化为酮戊二酸。酮戊二酸。2三羧酸循环三羧酸循环(TCA循环循环)的调节的调节 谷氨酸产生菌在代谢途径中，三羧酸循环的调节主要谷氨酸产生菌在代谢途径中，三羧酸循环的调节主要是通过是通过5种酶的调节进行的。这五种酶是磷酸烯醇式丙酮种酶的调节进行的。这五种酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酸羧化酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和酶和酮戊二酸脱氢酶。酮戊二酸脱氢酶。 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力并阻遏柠檬酸合成酶谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力并阻遏柠檬酸合成酶的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。 草酰乙酸草酰乙酸+谷氨酸谷氨酸谷氨酸转氨酶谷氨酸转氨酶天冬氨酸天冬氨酸+- -酮戊二酸酮戊二酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制。馈抑制。反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用抑制作用。反馈抑制与反馈抑制与反馈阻遏反馈阻遏的区别在于：的区别在于：反馈阻遏是转录水平的调节反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢，产生效应慢，反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。此外，前者的作用往往会影响催反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。此外，前者的作用往往会影响催化一系反应的多个化一系反应的多个酶酶，而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。，而后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用。 异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶活力强，而异柠檬酸裂解酶活力不活力强，而异柠檬酸裂解酶活力不能太强，这就有利于谷氨酸前体物能太强，这就有利于谷氨酸前体物酮戊二酸的生成，酮戊二酸的生成，满足合成谷氨酸的需要。满足合成谷氨酸的需要。 异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成酮戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶催化的酮戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶催化的酮戊二酸还酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反应，原氨基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反应，细胞内细胞内酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，当当酮戊二酸过量时，对异柠檬脱氢酶发生反馈抑制酮戊二酸过量时，对异柠檬脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成作用，停止合成酮戊二酸。酮戊二酸。 在谷氨酸的生物合成中，谷氨酸脱氢酶和异柠檬在谷氨酸的生物合成中，谷氨酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶在铵离子存在下，两者非常密切地偶联起酸脱氢酶在铵离子存在下，两者非常密切地偶联起来，来，形成强固的氧化还原共轭体系形成强固的氧化还原共轭体系，不与，不与NADPH2的末端氧化系相连接，使的末端氧化系相连接，使酮戊二酸还原氨基化生酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。成谷氨酸。 沿着由柠檬酸至沿着由柠檬酸至酮戊二酸的氧化途径，谷氨酸产酮戊二酸的氧化途径，谷氨酸产生菌有两种生菌有两种NADP专性脱氢酶，即专性脱氢酶，即异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶和和L谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶。 由于由于谷氨酸产生菌谷氨酸产生菌的的谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶比其它微生比其它微生物强物强大大得多，所以由三羧酸循环所得的柠檬酸的氧得多，所以由三羧酸循环所得的柠檬酸的氧化中间物就不再往下氧化，而以谷氨酸的形式积累化中间物就不再往下氧化，而以谷氨酸的形式积累起来。起来。 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏。若铵离子进一步过剩供给时，发酵液偏酸性，阻遏。若铵离子进一步过剩供给时，发酵液偏酸性，pH在在5.56.5，谷氨酸会进一步生成，谷氨酸会进一步生成谷氨酰胺谷氨酰胺。在谷氨酸产生菌中，在谷氨酸产生菌中，酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶先天先天性性缺失或微弱缺失或微弱，对导向谷氨酸形成具有重要意，对导向谷氨酸形成具有重要意义，这是谷氨酸产生菌糖代谢的一个义，这是谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征重要特征。谷氨酸产生菌的谷氨酸产生菌的酮戊二酸氧化力微弱，尤其酮戊二酸氧化力微弱，尤其在生物素缺乏的条件下，三羧酸循环到达在生物素缺乏的条件下，三羧酸循环到达酮酮戊二酸时即受到阻挡，这有利于戊二酸时即受到阻挡，这有利于酮戊二酸的酮戊二酸的积累，然后生成谷氨酸。积累，然后生成谷氨酸。 3乙醛酸循环乙醛酸循环(DCA循环循环)的调节的调节 乙乙醛醛酸循酸循环环中的关中的关键键酶酶是是异异柠柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶和和苹果酸苹果酸酶酶。通。通过过乙乙醛醛酸循酸循环环异异柠柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶的催化作用使的催化作用使琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补补足，其反足，其反应应如下：如下： 葡萄糖葡萄糖和和琥珀酸琥珀酸等等对对异异柠柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶起着阻遏作用。起着阻遏作用。 在在生物素亚适量生物素亚适量条件下，琥珀酸氧化力降低，条件下，琥珀酸氧化力降低，积累的琥珀酸会积累的琥珀酸会反馈抑制反馈抑制异柠檬酸裂解酶活性，并异柠檬酸裂解酶活性，并阻遏该酶的生成，阻遏该酶的生成，DCA循环基本处于封闭状态，异循环基本处于封闭状态，异柠檬酸高效率地转化为柠檬酸高效率地转化为酮戊二酸，酮戊二酸，再生成谷氨再生成谷氨酸酸。 在在生物素充足生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增大，通过增大，通过DCA循环提供能量，进行蛋白质的合成，循环提供能量，进行蛋白质的合成，不仅异柠檬酸转化生成谷氨酸的反应减弱使得谷氨不仅异柠檬酸转化生成谷氨酸的反应减弱使得谷氨酸减少，而且生成的谷氨酸在转氨酶的催化作用下酸减少，而且生成的谷氨酸在转氨酶的催化作用下又转成其它氨基酸，也又转成其它氨基酸，也不利于谷氨酸积累不利于谷氨酸积累。 (1)以糖质为原料的谷氨酸发酵中生物素对以糖质为原料的谷氨酸发酵中生物素对DCA循环的影响循环的影响以醋酸为原料发酵谷氨酸时，以醋酸为原料发酵谷氨酸时，醋酸浓度要低醋酸浓度要低，高浓度，高浓度的醋酸易被完全氧化。的醋酸易被完全氧化。当菌体内的有机酸浓度当菌体内的有机酸浓度低低到一定程度，到一定程度，DCA循环循环启动启动，此时异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内的草此时异柠檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸与细胞内的草酰乙酸共同酰乙酸共同抑制抑制异柠檬酸异柠檬酸脱氢酶脱氢酶，TCA循环转为循环转为DCA循环，不利于谷氨酸生成与积累；循环，不利于谷氨酸生成与积累；当当DCA循环运转使得循环运转使得TCA循环包含的某些有机酸过剩循环包含的某些有机酸过剩时，异柠檬酸时，异柠檬酸裂解酶被抑制裂解酶被抑制，乙醛酸浓度下降，解除，乙醛酸浓度下降，解除对异柠檬酸脱氢酶的抑制，对异柠檬酸脱氢酶的抑制，TCA循环运转。循环运转。(2)以醋酸为原料的谷氨酸发酵对以醋酸为原料的谷氨酸发酵对DCA循环的影响循环的影响 4CO2固定反应的调节固定反应的调节 COCO2 2固定反固定反应应主要通主要通过过以下途径完成：以下途径完成：C02的固定反应的作用：的固定反应的作用：补充草酰乙酸补充草酰乙酸；在谷氨酸合成过程中，在谷氨酸合成过程中，糖的分解代谢途径与糖的分解代谢途径与C02固定固定的适当比例的适当比例是提高谷氨酸对糖收率的是提高谷氨酸对糖收率的关键关键问题。问题。 5NH4+的调节的调节 谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶也能催化谷氨酸氧化也能催化谷氨酸氧化脱氨反应脱氨反应，脱，脱氨过程以氨过程以NAD+作为辅酶，该酶催化的反应虽然作为辅酶，该酶催化的反应虽然偏向偏向氨合成谷氨酸一边，但是脱氢过程产生的氨合成谷氨酸一边，但是脱氢过程产生的NADH被氧被氧化成化成NAD+，同时产生的，同时产生的NH3很容易被除去。很容易被除去。 脱氨反应被脱氨反应被NH4+和和酮戊二酸所酮戊二酸所抑制抑制，这对于谷，这对于谷氨酸的氨酸的积累积累也起到了很好的作用。也起到了很好的作用。 在谷氨酸发酵生产中，在谷氨酸发酵生产中，生物素缺陷型菌生物素缺陷型菌在在NH4+存在时，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率存在时，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率高；高； NH4+不存在时，葡萄糖消耗速率很慢，生成不存在时，葡萄糖消耗速率很慢，生成物是物是酮戊二酸、丙酮酸等物质，不产生谷氨酸。酮戊二酸、丙酮酸等物质，不产生谷氨酸。 四、细胞膜通透性的调节四、细胞膜通透性的调节 对谷氨酸发酵的重要性对谷氨酸发酵的重要性：当细胞膜转变为有利于谷当细胞膜转变为有利于谷氨酸向膜外渗透的方式，氨酸向膜外渗透的方式，谷氨酸才能不断地谷氨酸才能不断地排出细排出细胞外胞外，这样既有利于细胞，这样既有利于细胞内谷氨酸内谷氨酸合成反应的优先合成反应的优先性、连续性性、连续性，也有利于谷，也有利于谷氨酸在氨酸在胞外的积累胞外的积累。细胞膜是在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有细胞膜是在细胞壁与细胞质之间的一层柔软而富有弹性的弹性的半渗透性膜半渗透性膜，磷脂双分子层磷脂双分子层为其基本结构，为其基本结构，在双分子层中在双分子层中镶嵌蛋白质镶嵌蛋白质。 一种是通过控制脂肪酸和甘油的合成，实现对磷脂一种是通过控制脂肪酸和甘油的合成，实现对磷脂合成的控制，使得细胞合成的控制，使得细胞不能形成完整的细胞膜不能形成完整的细胞膜；一种是通过一种是通过干扰细菌细胞壁的形成干扰细菌细胞壁的形成，使得细胞不能，使得细胞不能形成完整的细胞壁，丧失了对细胞膜的保护作用。形成完整的细胞壁，丧失了对细胞膜的保护作用。在膜内外渗透压差等因素影响下，在膜内外渗透压差等因素影响下，细胞膜物理性损细胞膜物理性损伤，增大膜的通透性伤，增大膜的通透性。根据细胞膜的结构特性，根据细胞膜的结构特性，控制细胞膜控制细胞膜通透性的方法通透性的方法主要有两种：主要有两种：1控制细胞膜的形成控制细胞膜的形成 利用利用生物素缺陷型菌株生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，进行谷氨酸发酵时，限制限制发酵培养基中生物素的浓度。发酵培养基中生物素的浓度。 生物素参与了脂肪酸的生物合成，进而影响了生物素参与了脂肪酸的生物合成，进而影响了磷脂的合成和细胞膜的形成。磷脂的合成和细胞膜的形成。 生物素是催化脂肪酸合成起始反应的关键酶生物素是催化脂肪酸合成起始反应的关键酶乙酰乙酰CoA羧化酶的辅酶羧化酶的辅酶，对脂肪酸的形成起促进作用。，对脂肪酸的形成起促进作用。选育生物素缺陷型菌株，阻断生物素合成，亚适量选育生物素缺陷型菌株，阻断生物素合成，亚适量控制生物素添加，控制生物素添加，抑制不饱和脂肪酸的合成抑制不饱和脂肪酸的合成，使得，使得细胞膜不完整细胞膜不完整，提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。，提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。利用利用生物素过量的糖蜜原料生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时，进行谷氨酸发酵时，添添加加表面活性剂或饱和脂肪酸。表面活性剂或饱和脂肪酸。 在生物素过量的条件下，添加表面活性剂或饱和在生物素过量的条件下，添加表面活性剂或饱和脂肪酸仍能进行谷氨酸发酵，其原因在于脂肪酸仍能进行谷氨酸发酵，其原因在于这些物质对这些物质对生物素起拮抗作用生物素起拮抗作用，抑制不饱和脂肪酸的合成，导致，抑制不饱和脂肪酸的合成，导致油酸合成量减少，磷脂合成不足，使得油酸合成量减少，磷脂合成不足，使得细胞膜不完整细胞膜不完整，提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。常用的表面活性剂提高了细胞膜对谷氨酸的通透性。常用的表面活性剂有吐温有吐温60、吐温、吐温40等。常用的饱和脂肪酸有十七烷等。常用的饱和脂肪酸有十七烷酸、硬脂酸等。酸、硬脂酸等。利用利用油酸缺陷型菌株油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，进行谷氨酸发酵，限制限制发酵培养基发酵培养基油酸的浓度。油酸的浓度。 油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力，直接影油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力，直接影响磷脂的合成，响磷脂的合成，不能形成完整细胞膜不能形成完整细胞膜，必须添加油酸才能，必须添加油酸才能生长，所以通过控制油酸的添加量，实现细胞膜对谷氨酸生长，所以通过控制油酸的添加量，实现细胞膜对谷氨酸的通透性。的通透性。 当当油酸过量油酸过量时，该菌株只长菌或产酸少；当时，该菌株只长菌或产酸少；当油酸亚适油酸亚适量量时，随着油酸的耗尽，细胞膜结构与功能发生变化，使时，随着油酸的耗尽，细胞膜结构与功能发生变化，使得谷氨酸的通透性提高。得谷氨酸的通透性提高。一种脂肪酸。一种脂肪酸。分子式分子式C18H34O2 甘油缺陷型菌株不能自身合成甘油缺陷型菌株不能自身合成磷酸甘油和磷脂，外界供给甘油磷酸甘油和磷脂，外界供给甘油才能使其生长，因此可以通过控才能使其生长，因此可以通过控制甘油添加量来控制细胞膜对谷制甘油添加量来控制细胞膜对谷氨酸的通透性。氨酸的通透性。 当甘油添加量当甘油添加量过多过多时，磷脂正时，磷脂正常合成，菌体正常生长，不产酸常合成，菌体正常生长，不产酸或产酸低；或产酸低； 当甘油添加量当甘油添加量过少过少时，菌体生时，菌体生长不好，产酸低，所以控制甘油长不好，产酸低，所以控制甘油亚适量是控制的关键。亚适量是控制的关键。利用利用甘油缺陷型菌株甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，进行谷氨酸发酵，限制限制发酵培养基甘油的浓度。发酵培养基甘油的浓度。 2控制细胞壁的形成控制细胞壁的形成细胞壁的骨架结构细胞壁的骨架结构是肽聚糖。是肽聚糖。对细胞壁形成的控对细胞壁形成的控制方法：添加青霉制方法：添加青霉素、头孢霉素素、头孢霉素C等等内酰胺类抗生素。内酰胺类抗生素。 双糖单位：双糖单位：N乙酰胞壁酸（乙酰胞壁酸（NAM）和）和N乙乙酰葡萄糖胺（酰葡萄糖胺（NAG） 青霉素是糖肽末端结构青霉素是糖肽末端结构(DAlaDAla)的的类似物类似物，与转肽酶的活性中心结合，使转肽酶受到了不可逆的与转肽酶的活性中心结合，使转肽酶受到了不可逆的抑制，糖肽合成不能完成，结果形成不完整的细胞壁，抑制，糖肽合成不能完成，结果形成不完整的细胞壁，使细胞膜处于无保护状态，易于破损，增大谷氨酸的使细胞膜处于无保护状态，易于破损，增大谷氨酸的通透性。通透性。 转肽酶功能：在蛋白质生物合成过程中肽键的形成具有必须的作用。转转肽酶功能：在蛋白质生物合成过程中肽键的形成具有必须的作用。转肽酶识别特异多肽肽酶识别特异多肽,催化不同的转肽反应。催化不同的转肽反应。 青霉素控制细胞壁形成的原因：青霉素控制细胞壁形成的原因：第二节第二节 谷氨酸产生菌的选育谷氨酸产生菌的选育主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属和节杆菌属主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属和节杆菌属中的细菌。中的细菌。目前，我国企业使用的谷氨酸产生菌主要有：目前，我国企业使用的谷氨酸产生菌主要有：北京棒杆菌北京棒杆菌AS 1299；钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌AS 1542；天津短杆菌天津短杆菌T613；它们的各种突变株。它们的各种突变株。黄色短杆菌黄色短杆菌北京棒杆菌北京棒杆菌杆状细菌 谷氨酸菌体的选育方法主要有五种，谷氨酸菌体的选育方法主要有五种，自然选育、自然选育、诱变选育、杂交选育、代谢控制选育和基因工程选诱变选育、杂交选育、代谢控制选育和基因工程选育。育。 一、自然选育一、自然选育以以基因自发突变基因自发突变为基础。为基础。有利于谷氨酸产生菌保持纯系良种有利于谷氨酸产生菌保持纯系良种，使谷氨酸生产，使谷氨酸生产具有相对稳定性，提高发酵水平。具有相对稳定性，提高发酵水平。缺点：缺点：菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作用，使得自发突变率极低，导致选育耗时长、工作用，使得自发突变率极低，导致选育耗时长、工作量大、效率低。量大、效率低。也称自然分离，是指对微生物细胞群体不经过人工也称自然分离，是指对微生物细胞群体不经过人工处理而直接进行筛选的处理而直接进行筛选的育育种方法。种方法。 二、诱变选育二、诱变选育 物理因素物理因素：紫外线、：紫外线、60Co、X射线、射线、射线、快中射线、快中子、子、射线、射线、射线、超声波、射线、超声波、HeNe激光辐照、激光辐照、离子束等。离子束等。化学因素：化学因素：氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、酸乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、5氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、5溴尿嘧啶等。溴尿嘧啶等。其它因素其它因素：生物诱导因子，如噬菌体诱发抗性突变：生物诱导因子，如噬菌体诱发抗性突变等。等。 例：例：王岁楼；张一震；李志。谷氨酸高产菌王岁楼；张一震；李志。谷氨酸高产菌TZ-310TZ-310的诱变的诱变选育及其发酵的研究选育及其发酵的研究。中国调味品中国调味品，19971997年年 0909期期。 摘要：以天津短杆菌摘要：以天津短杆菌- -为出发菌株，经为出发菌株，经射线射线、紫外线紫外线和和硫酸二乙酯硫酸二乙酯复合诱变并经高温复合诱变并经高温驯化，获得一株琥珀酸和生物素双营养缺陷型突变株。驯化，获得一株琥珀酸和生物素双营养缺陷型突变株。该菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（）、不分解利该菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（）、不分解利用及耐高温（用及耐高温（）的优点。）的优点。原生质体融合原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，制得原生质体或原生质球，在高渗条件下用加以剥除，制得原生质体或原生质球，在高渗条件下混合，由聚乙二醇混合，由聚乙二醇(PEG)助融，促使原生质体凝集、融助融，促使原生质体凝集、融合，两个基因组之间接触、交换、遗传重组，在再生细合，两个基因组之间接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。胞中获得重组体。 三、杂交育种三、杂交育种杂交育种杂交育种常规杂交常规杂交原生质体融合原生质体融合谷氨酸产生菌的前处理谷氨酸产生菌的前处理因为其有着特殊的细胞壁结构，对溶菌酶一般不因为其有着特殊的细胞壁结构，对溶菌酶一般不敏感。敏感。方法：加入方法：加入EDTA（乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸 ）、甘氨酸、青霉）、甘氨酸、青霉素和素和D环丝氨酸等，这些物质可以使细胞壁变得环丝氨酸等，这些物质可以使细胞壁变得疏松，便于溶菌酶处理。疏松，便于溶菌酶处理。如，李蒲兴等将如，李蒲兴等将6株谷氨酸产生菌以株谷氨酸产生菌以甘氨酸、青霉素和溶菌酶的甘氨酸、青霉素和溶菌酶的不同组合不同组合处理处理，对其原生质体形成进行比较，对其原生质体形成进行比较，在最佳条件下，原生质体在最佳条件下，原生质体形成率形成率可达可达95100。 张蓓等以谷氨酸产生菌天津短杆菌张蓓等以谷氨酸产生菌天津短杆菌T613为出发菌株，获得了具有目的遗传为出发菌株，获得了具有目的遗传标记寡霉素抗性标记寡霉素抗性(Orm)和氟乙酸抗性和氟乙酸抗性(FEAr)的突变株的突变株TN63和和TN115。然后，。然后，分别以分别以TN63和和TN115为亲株，通过为亲株，通过原生质体融合，获得了具有原生质体融合，获得了具有Orm +FEAr标记的融合子标记的融合子FTN9108，其原生，其原生质体融合频率为质体融合频率为2.6103。OrmFEAr+OrmFEArOrmFEAr四、代谢控制选育四、代谢控制选育 以诱变育种为基础，获得以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过微生物正各种解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择而人为地使有用产物选择性地大量生成积累。性地大量生成积累。 Glu产生菌产生菌诱变育种诱变育种突变株突变株代谢控制发酵代谢控制发酵大量积累大量积累Glu1.选育耐高糖、高谷氨酸的菌株选育耐高糖、高谷氨酸的菌株 如选育在含如选育在含2030葡萄糖的平板上生长良好的葡萄糖的平板上生长良好的耐高糖突变株；耐高糖突变株；在含在含15 20味精的平板上生长良好的耐高谷味精的平板上生长良好的耐高谷氨酸突变株；氨酸突变株；在在20的葡萄糖加的葡萄糖加15味精的平板上生长良好的耐味精的平板上生长良好的耐高糖、耐高谷氨酸的菌株。高糖、耐高谷氨酸的菌株。2.选育能强化谷氨酸合成代谢、削弱或阻断选育能强化谷氨酸合成代谢、削弱或阻断支路代谢的菌株支路代谢的菌株（1）选育不分解利）选育不分解利用谷氨酸的突变株用谷氨酸的突变株 选育在以选育在以谷氨酸为谷氨酸为唯一碳源唯一碳源培养基上培养基上不长或生长微弱的不长或生长微弱的突变株突变株 。谷氨酸谷氨酸谷氨酰胺鸟氨酸瓜氨酸精氨酸（2）选育强化）选育强化CO2固定反应的突变株固定反应的突变株 a.选育选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源，生长良好以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源，生长良好的的菌株。因为细胞内碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧菌株。因为细胞内碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反应，该反应与反应，该反应与C02固定反应是相同酶所催化，固定反应是相同酶所催化，C02固定反应相应地加强。固定反应相应地加强。b.选育选育氟丙酮酸敏感氟丙酮酸敏感突变株。突变株。因为氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，即抑制因为氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，即抑制丙酮酸向乙酰丙酮酸向乙酰CoA转化，相应地转化，相应地CO2固定反应加强。固定反应加强。突变株对氟丙酮酸越敏感，效果越理想。突变株对氟丙酮酸越敏感，效果越理想。c.选育选育减弱乙醛酸循环减弱乙醛酸循环的突变株。的突变株。乙醛酸循环减弱不仅能使乙醛酸循环减弱不仅能使C02固定反应比例增大，固定反应比例增大，而且异柠檬酸也能高效率地转化为而且异柠檬酸也能高效率地转化为酮戊二酸，酮戊二酸，再生成谷氨酸。常见的该突变株有琥珀酸敏感型再生成谷氨酸。常见的该突变株有琥珀酸敏感型突变株和不分解利用乙酸的突变株。突变株和不分解利用乙酸的突变株。（3）选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的）选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株突变株 有酮基丙二酸抗性突变株、谷氨酸结构类似物抗性有酮基丙二酸抗性突变株、谷氨酸结构类似物抗性突变株和谷氨酰胺抗性突变株。突变株和谷氨酰胺抗性突变株。草酰乙酸草酰乙酸谷氨酸转氨酶谷氨酸转氨酶天冬氨酸天冬氨酸+- -酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸- -酮戊二酸酮戊二酸NH3谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶（4）选育强化能量代谢的突变株）选育强化能量代谢的突变株 原因：使原因：使TCA循环前一段代谢加强，谷氨酸合成速循环前一段代谢加强，谷氨酸合成速率加快。率加快。a.选育呼吸链抑制剂抗性突变株选育呼吸链抑制剂抗性突变株 如可选育丙二如可选育丙二酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株来酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株来实现。实现。b.选育选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株磷酸化抑制剂抗性突变株 如可选育如可选育2,4二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实现。现。c.选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株 如如可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。（5）其它遗传标记）其它遗传标记 选育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶类似物、抗核苷酸选育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶类似物、抗核苷酸类抗生素、异亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸类抗生素、异亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、缺陷、AEC抗性、抗性、AHV抗性、棕榈酰谷氨酸等突变抗性、棕榈酰谷氨酸等突变株，都可以不同程度地提高谷氨酸产量。株，都可以不同程度地提高谷氨酸产量。3.选育能提高谷氨酸通透性的菌株选育能提高谷氨酸通透性的菌株 （1）选育）选育生物素缺陷型生物素缺陷型菌株。菌株。（2）选育）选育油酸缺陷型油酸缺陷型菌株。菌株。（3）选育）选育甘油缺陷型甘油缺陷型菌株。菌株。（4）选育）选育温度敏感型温度敏感型突变株突变株 突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜细胞膜结构的基因结构的基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换，这样为基因所控制的酶在高温下失活，导个碱基所置换，这样为基因所控制的酶在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变。致细胞膜某些结构的改变。 另一个特点是在生物素丰富的培养基上也能分泌出谷氨另一个特点是在生物素丰富的培养基上也能分泌出谷氨酸。酸。 (5)其它突变型菌株其它突变型菌株抗药性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙抗药性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙酸缺陷型、棕榈酰谷氨酸敏感型突变株等，都能酸缺陷型、棕榈酰谷氨酸敏感型突变株等，都能增增强谷氨酸的通透性强谷氨酸的通透性。 五、基因工程选育五、基因工程选育 基因工程育种是指利用基因工程方法对产生菌株进基因工程育种是指利用基因工程方法对产生菌株进行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的转基因而获得新菌种的育种方法。转基因而获得新菌种的育种方法。 载体系统载体系统 ：一般以质粒、噬菌体或转座子作为载体，尤以质粒为：一般以质粒、噬菌体或转座子作为载体，尤以质粒为多。多。 受体系统受体系统 ：受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株。：受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株。 供体菌株供体菌株：供体菌株选择短杆菌属及棒杆菌属的野生菌或变异：供体菌株选择短杆菌属及棒杆菌属的野生菌或变异株。株。 工具酶：工具酶：切割供体切割供体DNA和载体和载体DNA的工具酶的工具酶限制性内切限制性内切核酸酶有许多种，核酸酶有许多种，Hind、Bcl I、Xba I和和Xam I效果最好。效果最好。 载体系统载体系统 受体系统受体系统 供体菌株供体菌株 工具酶工具酶 谷氨酸产生菌的许多谷氨酸产生菌的许多关键酶的基因关键酶的基因已被已被克隆克隆，Ozaki等克等克隆了谷氨酸棒杆菌的分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶基因，隆了谷氨酸棒杆菌的分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶基因，通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌，产量提高了通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌，产量提高了50。 周盛等从大肠杆菌周盛等从大肠杆菌E.coli k12中通过中通过PCR克隆出克隆出磷酸果糖磷酸果糖激酶编码基因激酶编码基因(pfkA)，将其连到表达，将其连到表达载体载体，连接构建成重，连接构建成重组质粒组质粒pKu1，转化转化谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌B4，并得到表达；酶活，并得到表达；酶活性测定表明性测定表明pfkA基因表达活力为基因表达活力为128.6o.86ug的蛋的蛋白。同时，转化子菌株对白。同时，转化子菌株对糖转化率糖转化率比比B4高高10.64，产酸产酸率率比比B4高高17.1。