荧光实时定量荧光实时定量PCR检测技术检测技术标准曲线绘制一 目的：采用SYBR green I 法绘制荧光定量PCR反应标准曲线，建立CT值与样品量之间的线性关系。二 概述在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号改变实现实时监测整个PCR进程，并对起始模板进行定量分析的方法。该法具有特异性更强，灵敏度高，自动化程度高、操作简单等特点。三 SYBR Green I法原理：SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，在特定波长激发光的照射下发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 *SYBR Green也能和非特异性的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析。熔解曲线分析。四、结果解析：标准曲线分析标准曲线分析：以基因组DNA、PCR产物、纯化的质粒DNA，cDNA作为标准品，梯度稀释（稀释倍数通常为10）准确配制标准品系列，然后进行荧光定量反应，绘制标准曲线。同步进行检测样品的荧光定量PCR反应，根据标准曲线即可获取未知样品的量。1.标准品制备及注意事项标准品制备及注意事项要求5点以上制备方法：选择目标、制备、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释。a. CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间b.10倍连续梯度稀释操作方法：1 取1v标准品原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii2 取1v稀释的标准品(标准品ii)+9v稀释缓冲液，得标准品iii3 取1v稀释2次的标准品(标准品iii) +9v稀释缓冲液，得标准品iv4 取1v稀释3次的标准品(标准品iv) +9v稀释缓冲液，得标准品v *切不可由标准品i加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、vc. 标准品的性质决定最终结果的性质：1.DNA标准品，已知拷贝数绝对定量，得未知样品拷贝数 50g/ml 1kb DNA 的摩尔数为的摩尔数为4.741013/ml2.DNA标准品，已知ng/uL绝对定量，得未知样品ng/uL3.DNA标准品，未知拷贝数或浓度，已知稀释倍数相对定量，得未知样品之间相差倍数4.RNA标准品，已知ng/uL，与未知样品同样反转录，梯度稀释cDNA相对定量，得未知样品ng RNA/uL理想的标准曲线理想的标准曲线相关系数（相关系数（r2）：大于）：大于0.98，越接近，越接近1，结果可信度越高。，结果可信度越高。 扩增效率（扩增效率（E）：）：0.8-1.2, 越接近越接近1，越理想。，越理想。扩增效率（扩增效率（E）计算方法）计算方法标准曲线标准曲线X轴表示轴表示Ct值，值，Y轴表示起始模板浓度轴表示起始模板浓度（log10) E=10-1/a-1 绝对定量：绝对定量：优优 点点 给出的是目标基因的绝对数量给出的是目标基因的绝对数量缺缺 点点 必须有标准样品必须有标准样品 标准样品的基因数量必须准确测定。标准样品的基因数量必须准确测定。相对定量相对定量比较不同样品的基因表达量比较不同样品的基因表达量(无单位无单位) 相对标准曲线方法或者相对标准曲线方法或者Ct方法方法 任何任何DNA或者或者RNA，只要含有目标基因，只要含有目标基因 都可以用来制备相对标准曲线都可以用来制备相对标准曲线需要校正加样误差需要校正加样误差 管家基因管家基因（endogenous control）校正校正应用最广泛的方法应用最广泛的方法融解曲线分析融解曲线分析SYBR Green I法进行检出时，法进行检出时，要根据融解曲线确认要根据融解曲线确认PCR产物的特异性产物的特异性特异性产物特异性产物非特异性产物非特异性产物引物二聚体引物二聚体目标基因目标基因内对照基因内对照基因IL-2IL-218S18S比较Ct法（Ct法）:假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出：目的基因的量=2-Ct 其中： Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照 2-Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数Normalization Gene (内对照基因)其表达水平是恒定的(需要用户自己确认)校正模板在核酸数量上的差异比如SampleCalibrator比如处理后处理后处理前处理前Calibrator Sample（基准样品）得出相对于某一个样品的基因表达量, 1X sample.Treated vs. Untreated, 0 hr vs. 6 hr, Normal vs. Diseased.在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接通过比较Ct法（Ct法）得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线，更为简便省时，也是相当可靠的。IL-2 Ave Ct18SAve CtNormalizedIL-2 Exp.(Ct)CalibratedIL-2 Exp.(Ct)FoldDifference2-(Ct)0 Hr24.512.611.9012 Hr23.212.510.7-1.22.324 Hr25.411.613.81.9.27 (4fold decrease)主要试剂及仪器：试剂：SYBRPremixEXTaqkit(TaKaRa)标注品DNA仪器：荧光定量PCR仪（stratagene公司的MX3000P）实验步骤1.将标准品样品及荧光定量试剂取出解冻。2.用easydilutionbuffer将DNA样品做系列稀释，按照10倍连续梯度稀释法稀释，做5个梯度。按下表配制反应体系(为单管反应)，由于同一样品一般至少要重复三次，所以在下反应数量基础上乘3，获得一个总反应体系。2mastermix10lprimermix(2M)2lDNA1l50ROX0.4lddH2O6.6ltotal20l4按每管的反应体积分装至专用的定量PCR管的每一管中，最后将不同稀释倍数的标准品按顺序加入各管中，每管1l，盖上盖子，离心。5.上机。参数设置：荧光染料的选择样品孔的设定：标注品，未知样品，NC等反应条件设定：95,30s;95,5s；58,30s；72,30s开始循环，40cycles;95,1min,55,30s,95,30s绘制融解曲线。结果分析：参考结果解析。注意事项：1. 一般推荐的primer终浓度为200 nM ；2. 由于SYBR Green也能和非特异性的双链DNA结合发光，所以必须反应结束后要做熔解曲线分析；3. 样品和标准品都要重复，且重复次数须遵循统计学要求；4. 实验人员要尽可能减少样品间交叉污染的可能，避免将核酸从一个实验带入下一个实验，如在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸头，并不能用手直接触摸离心管的底部等。5.在实验进行之前一般做常规的 PCR 实验，验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适，同时确定实验的最佳反应体系和反应条件。6.配制反应体系过程中若需标记，请在试管架或离心机管架上标记，不要直接标记在离心管上。