实验五五 碱性磷酸碱性磷酸酶米氏常数米氏常数的的测定定实验碱性磷酸酶米氏常数的测定一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km和Vm值。实验碱性磷酸酶米氏常数的测定二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析1原理实验碱性磷酸酶米氏常数的测定2主要方法：（1）比较吸收光谱曲线（2）比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。1.苯丙氨酸2.酪氨酸3.色氨酸实验碱性磷酸酶米氏常数的测定（3）比较吸光度的比值纯DNA实验碱性磷酸酶米氏常数的测定（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析1原理Beer-Lambert（比尔）定律：T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=KCL其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度实验碱性磷酸酶米氏常数的测定2常用方法（1）标准曲线法OD或浓度标准曲线与样品的测定条件必须一致。实验碱性磷酸酶米氏常数的测定（2）标准管法CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。（3）摩尔吸光系数法C=A/（为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。实验碱性磷酸酶米氏常数的测定(三)米氏常数的测定原理酶促反应v-S曲线vS推导出米氏方程为：其中S为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数实验碱性磷酸酶米氏常数的测定米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/S作图，可得一条直线实验碱性磷酸酶米氏常数的测定1/v1/Vm-1/Km1/S本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-无色黄色可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。实验碱性磷酸酶米氏常数的测定三、试剂与器材三、试剂与器材试剂：0.5mol/mLpNP、10mmol/LpNPP、20mmol/LMgCl2、0.1mol/L碳酸钠碳酸氢钠pH10.1缓冲液、0.1mol/LNaOH、6 g/mL碱性磷酸酶酶液器材：恒温水浴锅、722分光光度计实验碱性磷酸酶米氏常数的测定四、分光光度计的使用实验碱性磷酸酶米氏常数的测定1722型分光光度计的外形实验碱性磷酸酶米氏常数的测定2.仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长实验碱性磷酸酶米氏常数的测定3.样品测试操作打开电源开关，使仪器预热20分钟用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A)将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。实验碱性磷酸酶米氏常数的测定返回实验碱性磷酸酶米氏常数的测定返回实验碱性磷酸酶米氏常数的测定返回实验碱性磷酸酶米氏常数的测定五、操作方法五、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作 取5支试管编号,0号一支,17号各二支,按下表操作：管号0123456pNP含量(mol)00.050.100.150.200.250.300.5mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.6H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.2Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mLOD405nm以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。实验碱性磷酸酶米氏常数的测定(二）测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。No.12345底物终浓度S(mM)0.50.751.01.5310mmol/LpNPP（mL）0.10.150.20.30.6蒸馏水（mL）0.50.450.40.30碳酸盐缓冲液（mL）各加1.0mL20mmol/LMgCl2（mL）各加0.2mL预热混匀，37，5分钟酶液（mL）测定管各加0.2mL酶液反应时间37，精确反应10分钟0.1mol/LNaOH（mL）各加2mL酶液（mL）空白管各补加0.2mL酶液OD405实验碱性磷酸酶米氏常数的测定（三）数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数),计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/S作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。实验碱性磷酸酶米氏常数的测定六、注意事项1.取液量一定要准确。2.反应时间一定要精确。3.加酶前后一定要将试剂混匀。4.空白对照一定要先加NaOH，后加酶。5.测定OD405时要以各自的空白调零点。6.移液管或取液器的使用7.比色杯的使用实验碱性磷酸酶米氏常数的测定返回实验碱性磷酸酶米氏常数的测定管号1122334455加酶时间（min）0.511.522.533.544.55加NaOH时间10.5 1111.5 1212.5 1313.5 1414.5 15反应时间（min）10101010101010101010返回实验碱性磷酸酶米氏常数的测定七、思考题七、思考题(1)试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。(2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？实验碱性磷酸酶米氏常数的测定实验碱性磷酸酶米氏常数的测定