复杂疾病的遗传学研究复杂疾病的遗传学研究研究设计与统计分析方法研究设计与统计分析方法北京大学公共卫生学院北京大学公共卫生学院流行病学与卫生统计学系流行病学与卫生统计学系陈大方陈大方 教授教授 内内 容容 1 1概述概述2 2研究设计方法研究设计方法3 3统计分析方法统计分析方法4 4分析实例分析实例 1概概 述述疾病的分类疾病的分类 随着人类基因组计划的完成和后基因组计划的开展，人们对于疾病的认识也越来越深入。已有的研究结果发现人类疾病都与基因受损有关，因此提出了基因病-人类疾病的新概念。由此提出将人类疾病分为三种类型。 第一类是单基因病。仅由单个基因DNA序列某个碱基对的改变就造成疾病，并且可以把这样的改变传递给后代。如血友病A、白化病等。 第二类是多基因病（复杂性疾病）。这类疾病的发生涉及两个以上基因的结构或表达调控的改变，主要指慢性非传染性疾病，如肿瘤、高血压、冠心病、糖尿病、哮喘病、骨质疏松症、神经性疾病、原发性癫痫等。 第三类为获得性基因病。主要是传染病由病原微生物通过感染将其基因入侵到宿主基因引起。如HIV。复杂性疾病的特征复杂性疾病的特征Genetic HeterogeneityGenetic Heterogeneity（遗传异质性）（遗传异质性）Gene-Gene and Gene-Environment Gene-Gene and Gene-Environment InteractionInteraction（基因基因，基因环境的交互作用（基因基因，基因环境的交互作用) )Incomplete PenetranceIncomplete Penetrance（不完全外显性）（不完全外显性）PhenocopyPhenocopy（拟表型）（拟表型）PleiotropyPleiotropy（多效性）（多效性）2研究设计方法研究设计方法患病家系成员设计患病家系成员设计优点:具有明显的孟德尔遗传特点。遗传方式确定（常显、常隐或X连锁）。缺点:如果指定的遗传方式不正确，可能导致错误的结论。难以收集到家系全部人员。患病家系成员设计患病家系成员设计患病同胞对设计患病同胞对患病同胞对表型不一表型不一致同胞对致同胞对患病同胞对设计患病同胞对设计优点:可以进行非参数统计分析。研究对象相对容易收集。缺点:检验效能相对较低样本量要求较大患病先证者核心家系设计患病先证者核心家系设计优点:可以进行非参数统计分析。研究对象相对容易收集。缺点:统计分析时仅仅杂合子的双亲可以有效利用。对于迟发性疾病难以收集到双亲资料。患病先证者核心家系设计患病先证者核心家系设计双生子研究设计双生子研究设计 通过比较在相似或不同环境中成长起来的同卵双生子及异卵双生子某一疾病或性状发生的一致性，来判断遗传与环境因素的作用。养子研究设计养子研究设计 通过比较、分析养子与其同胞及生身父母某疾病或性状的相似性和与其寄养同胞或养父母的相似性，研究在某种疾病或性状发生中遗传因素与环境因素相对作用的大小。家系研究中其它研究设计方法家系研究中其它研究设计方法半同胞研究设计半同胞研究设计 是指同父异母或同母异父的兄弟姐妹。根据半同胞中所研究疾病的患病情况，可分析疾病或遗传性状来自父方或母方。病例对照研究设计病例对照研究设计优点:相对容易收集到资料。 投入少，产出高。缺点:由于存在连锁不平衡和种群分层， 容易导致假阳性或假阴性。病例对照研究设计病例对照研究设计背背 景景19941994年年PiegorsehPiegorseh、BegsBegs等提出等提出 遗传与环境的关系遗传与环境的关系 交互作用交互作用单纯病例研究单纯病例研究 应用前提条件应用前提条件 在在正正常常人人群群中中基基因因型型与与环环境境暴暴露露各各自自独独立立发发生生， 所研究疾病为罕见病。所研究疾病为罕见病。衍生的研究设计方法衍生的研究设计方法 研究示意图研究示意图单纯病例研究单纯病例研究环境暴露环境暴露基因型基因型病人病人+ +- -+ +- -+ +- -3统计分析方法统计分析方法 表型与基因型常规统计分析病例-父母三结构资料的TDT分析同胞数据SDT分析以家系为基础的关联分析 (FBAT)交互作用分析连锁分析单体型分析 全基因组关联分析 统计分析方法统计分析方法 分分析析基基因因型型与与表表型型的的关关系系，也也就就是是比比较较不不同同基基因因型型的的研研究究对对象象的的表表型型是是否否存存在在差差异异，如如基基因因型型不不同同，表型也显著不同，则表示两者有关。表型也显著不同，则表示两者有关。 表表型型为为连连续续型型变变量量的的基基因因型型之之间间比比较较可可用用t- t-检检验验、方差分析、方差分析、 GEE GEE等统计方法。等统计方法。 表表型型为为分分类类型型变变量量的的基基因因型型之之间间比比较较可可用用卡卡方方检检验、验、GEEGEE等统计方法。等统计方法。 表型与基因型常规统计分析交互作用的统计方法包括参数法和非参数法。参数法线性回归和Logistic回归模型。 非参数法（主要是数据挖掘方法）。(1)降维法；多因子降维法。(2)基于树的方法；分类回归树和随机森林法。(3)模式识别法；包括神经网络、支持向量机。(4)贝叶斯法：贝叶斯上位效应关联图谱。 参数法和非参数法分析交互作用时各有优缺点; 低维数据的分析可采用参数法和非参数法, 高维数据的分析则主要采用非参数法，交互作用的统计分析方法交互作用的统计分析方法 以吸烟与饮酒两个两分类变量为例，它们有四种可能的组合（如下表）:不饮酒不饮酒饮酒饮酒不吸烟不吸烟 0 0 0 0+ + a a吸烟吸烟 0 0+s s 0 0+a a+s s+sa sa我们可以形成一个四分类的变量，再用四个二分类变量X00、X01、X10、X11指示这四组，形成回归方程：回归分析法回归分析法方程I：f(Y)= 0+1X10+2X01+3X11 1是吸烟不饮酒组与不吸烟不饮酒组的差，2是不吸烟但饮酒组与不吸烟不饮酒组的差，3是吸烟又饮酒组与不吸烟不饮酒组的差。方程II：f(Y)=0+aalcohol+ssmoke+sasmoke*alcohol 回归系数的s不能简单地解释为吸烟的作用，而应确切地说是对不饮酒者吸烟的作用（等于方程I的1）。a不能简单地解释为饮酒的作用，而应确切地说是对不吸烟者饮酒的作用（等于方程I的2），因为s、a、0 三者间有相互依赖的关系。 回归分析法回归分析法方程I与方程II是等同的，方程I中的3 等于方程II中的a+s+sa 。方程I和II都有3个自变量(自由度)，都没有假定sa等于零，又称为饱和（Saturated）模型。从方程II中我们可以观察sa是否显著。如果我们假定吸烟与饮酒无交互作用，sa等于零，则方程II变为：方程III：f(Y)= 0+aalcohol+ssmoke只用a、s来拟合这四组，如果得到的似然数与方程I（II）没有显著差别，表明sa是多余的，或者说sa与零无显著性差异，吸烟与饮酒对f(Y)无交互作用。反之，吸烟与饮酒对f(Y)有交互作用。回归分析法回归分析法上面讲了交互作用的两种检验方法：方法I：模型中乘积项回归系数的检验（又称WALD TEST）。如上例sa的检验，如显著表示有交互作用；方法II：似然比检验（Log likelihood ratio test），具体方法为：计算卡方值：X2=2*（LL1-LL2）。如上例，LL1表示从方程I（或II）得出的似然对数；LL2表示从方程III得出的似然对数。计算自由度差。如上例，方程I（或II）有3个自变量，方程III只有2个自变量，差为1。按卡方检验，得出P值。一般来说，似然比检验效率高于回归系数的检验。回归分析法回归分析法优点: (1) 分析某个自变量的效应时, 可以同时控制多个协变量的影响; (2) 可以处理自变量对因变量的非线性效应; (3) 可以在模型中引入交互作用项; (4) 回归系数的可解释性。缺点: (1) 维度困扰的问题。维度困扰是指样本量有限而自变量较多(高维数据) 时, 分析交互作用时会使得观测数相对于自变量数过少, 数据分布在高维稀疏的列联表中, 此时维度困扰的问题会导致Logistic 回归模型中参数估计的错误, 或使回归系数的标准误过大, 从而导致I类错误或II类错误增加。(2)自变量之间的相关性会导致不同的建模策略( 前进法或后退法) , 并得到不同的结果。(3)Logistic 回归不能很好地解决遗传异质性的问题。Logistic回归分析多因子降维法多因子降维法 多 因 子 降 维 法 （ multifactor dimensionality reduction, MDR）是2001年发展出的一种非参数、无需遗传模式的高阶交互作用分析方法，在2007年又提出了一种基于MDR基本原理的扩展方法广义多因子降维法(generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR)，又称基于计分的多因子降维法(score-based MDR)。该法可以通过将广义线性模型的概念引人到MDR中，使其不但能够分析连续变量，且能够纳入协变量，从而控制协变量引起的干扰，提高预测的准确度。其主要特点：分析的基因表型和校正因素不限于离散型变量，也可以是连续型变量；可应用于多种数据结构(病例对照资料、人群随机抽样样本或其他类型样本)；结合GMDR software软件，可识别多个位点或环境因素之间的交互作用。 基本原理GMDR是对原始MDR的扩展，其基本原理包括计分统计量(score statistic)和交叉验证(cross validation）。计分统计量：通过计算每个个体的计分统计量均值是否超过某个设定标准(例如大于或等于1)，分别标记为“高危”或“低危”，单元格因此被分为2类，形成一维两水平的模型。交叉验证（Cross validation）：随机方式产生十等份几乎相同的数据子集，每次用十份中的九份作为训练样本，另一份称为留存数据（held-out data）作为测试样本，当十次全部完成后再将十次所得的平均绝对误差求均值，即为研究的预测误差。GMDR软件：目前最新的GMDR软件(版本beta 07)是基于Java程序编写的源代码开放的免费软件, http:/www.healthsystem.virginia.edu/intemet/addiction.genomics/Software/免费下载).文件类型：GMDR能够识别的文件包括三种，分别为 标 记 文 件 (marker file)， 协 变 量 与 表 型 文 件(covariate&phenotype file)以及计分文件(score file)。三者均为文本文件。结果输出:每个单元格的颜色由单元格的计分决定，蓝色为计分超过设定值，黄色为未超过设定值，白色表示单元格内没有数据。单元格中的左侧条带表示正计分之和，右侧条带表示负计分之和。优点: (1) 在单个SNP位点缺乏主效应时, 可以同时检测位点间的交互作用; (2) 将研究中的多因子组合以疾病易感性的方式分为高危和低危, 把高维结构降低到一维两水平, 降低了建模所需的自由度, 从而可以分析多个位点间的高阶交互作用；(3)GMDR能有效识别无主效应但具有交互作用的功能性SNP 位点; 存在5% 以下的基因分型错误和5% 的缺失数据时, 对降低GMDR的检验效能影响很小, 说明GMDR具有一定的稳健性。缺点: (1)如果使用穷尽搜索的方式检测最佳n因子组合, 由于该搜索方式非常耗时, GMDR只能用于分析中小规模预测变量数的交互作用, 而不能用于处理大规模数据(如全基因组关联研究的多个位点) 。(2)当数据中存在遗传异质性和拟表型时, GMDR的检验效能大大降低 。(3)GMDR将基因型组合简单地根据病例与对照的比值分为高风险组和低风险组, 当某种组合中病例数和对照数的比值接近于全部观测数据中的比值, 或者该组合中病例数和对照数都很少时, GMDR很容易发生分类错误, 导致假阳性率或假阴性率增高; 另外, 有些n因子组合的n维列联表的观测数可能为零, 此时就很难准确地将该组合归类为高风险组或是低风险组。GMDR分析 FBAT既适应于定性资料又适应于定量资料，并且可以先对表型变量经有关混杂因素进行调整，将调整后的残差值或校正值放入FBAT程序中进行分析，这样得到的结果就是经过混杂因素调整后的关联分析的结果。FBAT适用于各种类型的家系结构。有父母双亲、只有单亲、双亲均无、一个同胞、多个同胞的家系都可混合在一起应用，有效避免人群分层影响。软件：软件：http:/www.hsph.harvard.edu/fbat/default.htmlhttp:/www.hsph.harvard.edu/fbat/default.htmlFBAT FBAT 分析分析(Family-Based Association Test)(Family-Based Association Test)原理：FBAT以核心家系为单位计算每个核心家系数的基因型（X）的分布概率与统计量“S”（统计量S是表型T与基因型X的乘积），然后累加各核心家系的统计量S及S的方差与协方差，进行卡方检验。#fmy：进入分析的核心家系数。S：表示实际观察值，SX*G，X表示表型值，G表示基因型。即S等于表型值与基因型的乘积。E(s)：表示期望值，E(s)E(x)*G, E(x)表示期望的表型值，G表示基因型。即E(x)等于期望的表型值与基因型的乘积。 Var(s): 表示S的变异 Z：表示FBAT的统计值，ZS-E(S)/Var(s)2 , 由此来判断P值的大小。P：表示统计概率，以P0.05的水平来判断是统计结果否具有显著性。4分析实例分析实例Pharmacogenetics and Genomics 2009, 19:345352Genegene interactions of CYP2A6 and MAOA polymorphisms on smoking behavior in Chinese male population交互作用分析实例交互作用分析实例北京大学学报（医学版）2003：35（4）:377381Tumor necrosis factor-alpha gene G308A polymorphism is associated with the risk of preterm deliveryFBAT分析实例分析实例谢谢谢谢