微生物活菌平板计数方法和技术微生物活菌平板计数方法和技术微生物肥料和食用菌菌种质检中心微生物肥料和食用菌菌种质检中心曹凤明曹凤明微生物计数方法种类直接计数法直接计数法 核酸计数法核酸计数法活菌计数法（培养法）活菌计数法（培养法）1.MPN（Most-Probable-Number ）最大可能数法最大可能数法2.混菌法混菌法3.平板技术法平板技术法直接计数法直接计数法1. 显微镜直接计数显微镜直接计数2.比浊法比浊法3. 电子计数器计数法电子计数器计数法 1. 显微镜直接计数显微镜直接计数 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液血球计数板：菌体较大的酵母菌或霉菌孢子血球计数板：菌体较大的酵母菌或霉菌孢子细菌计数板：一般细菌细菌计数板：一般细菌用途：快速了解发酵液的菌数。常用于生产线上生产过用途：快速了解发酵液的菌数。常用于生产线上生产过程控制。程控制。缺点：不易区分颗粒、死菌体和杂菌，计数与真实菌数缺点：不易区分颗粒、死菌体和杂菌，计数与真实菌数有很大差异。不能作为正规计数方法。有很大差异。不能作为正规计数方法。2. 比浊法比浊法 根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD(OD值值值值) )表示样表示样表示样表示样品菌液浓度。根据浊度计算出细菌的数量。该方法一般可品菌液浓度。根据浊度计算出细菌的数量。该方法一般可品菌液浓度。根据浊度计算出细菌的数量。该方法一般可品菌液浓度。根据浊度计算出细菌的数量。该方法一般可以估计出细菌的数量级。以估计出细菌的数量级。以估计出细菌的数量级。以估计出细菌的数量级。 经常用于一些特殊的微生物的快速计数，如光合细菌和经常用于一些特殊的微生物的快速计数，如光合细菌和经常用于一些特殊的微生物的快速计数，如光合细菌和经常用于一些特殊的微生物的快速计数，如光合细菌和藻类的测数。但是由于该方法仅能估测菌数，不能准确定藻类的测数。但是由于该方法仅能估测菌数，不能准确定藻类的测数。但是由于该方法仅能估测菌数，不能准确定藻类的测数。但是由于该方法仅能估测菌数，不能准确定量，而且由于一些颗粒和添加剂的作用，不能正确反映该量，而且由于一些颗粒和添加剂的作用，不能正确反映该量，而且由于一些颗粒和添加剂的作用，不能正确反映该量，而且由于一些颗粒和添加剂的作用，不能正确反映该样品的质量，所以在质检过程中不予采用。样品的质量，所以在质检过程中不予采用。样品的质量，所以在质检过程中不予采用。样品的质量，所以在质检过程中不予采用。3. 3. 电子计数器计数法电子计数器计数法电子计数器计数法电子计数器计数法 工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。电子记录装置上。电子记录装置上。电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。不适于微生物肥料产品的检测。含任何碎片。不适于微生物肥料产品的检测。含任何碎片。不适于微生物肥料产品的检测。含任何碎片。不适于微生物肥料产品的检测。核酸计数法核酸计数法l每一种生物都有一套自己独有的遗传物质，脱氧核糖核酸和每一种生物都有一套自己独有的遗传物质，脱氧核糖核酸和核糖核酸，即核糖核酸，即DNA和和RNA。随着核酸分析技术的发展，已随着核酸分析技术的发展，已经能够利用遗传物质对生物进行定性和定量的测定，而且更经能够利用遗传物质对生物进行定性和定量的测定，而且更为灵敏、迅速、专一性强。为灵敏、迅速、专一性强。l常用的方法：荧光定量常用的方法：荧光定量PCRl此法操作精细繁琐，药品昂贵，而且经常受到死菌体的干扰。此法操作精细繁琐，药品昂贵，而且经常受到死菌体的干扰。暂时不能成为微生物肥料活菌计数的常用方法，暂时不能成为微生物肥料活菌计数的常用方法，活菌计数法（培养法）活菌计数法（培养法）MPN（Most-Probable-Number ）最大可能数法（主要最大可能数法（主要用于光合细菌和（粪）大肠菌群的测定）用于光合细菌和（粪）大肠菌群的测定）混菌法（适用于兼性厌氧微生物的测定）混菌法（适用于兼性厌氧微生物的测定） 取取1.0mL不同稀释度菌悬液于不同稀释度菌悬液于灭菌平皿内，将冷却至平皿内，将冷却至50左右的左右的1520mL培养基倒入培养皿内轻轻混匀，培培养基倒入培养皿内轻轻混匀，培养计数。养计数。 （食品中乳酸菌总菌数的测定）（食品中乳酸菌总菌数的测定）平板计数法（最常用的方法）平板计数法（最常用的方法）平板计数法平板计数法 使使不不可可见见的的微微生生物物在在人人工工培培养养基基平平板板上上生生长长成成为为可可见见的的菌菌落落（CFU），从从而而可可用用肉肉眼眼进进行行观观察察、计计数数。较较其其他他方方法法直直观观准准确确 ，是是一一种种经经典典的的检检测测活活菌菌数数的的方法，也是目前国际上通用的方法。方法，也是目前国际上通用的方法。制制备备一一定定体体积积的的菌菌悬悬液液，作作一一系系列列的的倍倍数数稀稀释释，然然后后将将定定量量的的稀稀释释液液进进行行平平板板培培养养，根根据据培培养养出出的的菌菌落数，计算出样品中的活菌数。落数，计算出样品中的活菌数。平板计数法示意图平板计数法示意图 平板计数的优缺点平板计数的优缺点优点：直观、准确、可靠优点：直观、准确、可靠 该方法不仅可以检测到样品中的有效活菌该方法不仅可以检测到样品中的有效活菌数，而且可以检测到产品的微生物污染情况，数，而且可以检测到产品的微生物污染情况，即杂菌数。即杂菌数。缺点：缺点： 由由于于培培养养基基和和培培养养条条件件的的局局限限性性，所所得得的的结果一般低于实际值。结果一般低于实际值。平板计数法平板计数法 （一）检测前的准备（一）检测前的准备（二）（二） 操作过程（母液制备、系列稀释、操作过程（母液制备、系列稀释、加样、涂布、培养、菌落识别、计数）加样、涂布、培养、菌落识别、计数）（三）（三） 计算计算（一）检测前的准备（一）检测前的准备根据菌种的特性选择方法根据菌种的特性选择方法天平，摇床，酒精灯，培养箱，染色液，天平，摇床，酒精灯，培养箱，染色液，显微镜，灭菌锅，烘箱等显微镜，灭菌锅，烘箱等无菌间或洁净工作台消毒无菌间或洁净工作台消毒吸管、刮刀、培养皿的洗涤、包扎、灭吸管、刮刀、培养皿的洗涤、包扎、灭菌菌制样和稀释用三角瓶水制备、灭菌制样和稀释用三角瓶水制备、灭菌培养基制备和平板制备培养基制备和平板制备培养基制备培养基制备培养基定义指人工方法配合而成的，专供微生培养基定义指人工方法配合而成的，专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保存用的混合营物培养、分离、鉴别、研究和保存用的混合营养物制品。养物制品。培养基的选择培养基的选择 需要了解目的微生物的基本特需要了解目的微生物的基本特性，选择正确的培养基性，选择正确的培养基培养基的制备程序培养基的制备程序按按微生物肥料实验用培养基技术条件微生物肥料实验用培养基技术条件规定执行，规定执行， NY/T1114-2006培养基标识清晰，培养基名称，配制日期等。培养基标识清晰，培养基名称，配制日期等。检测前的准备检测前的准备检测前的准备检测前的准备平板制备平板制备灭好菌的培养基冷却至灭好菌的培养基冷却至50 左右（以不烫手为宜），在无左右（以不烫手为宜），在无菌状态下倾注培养基。菌状态下倾注培养基。倾倒平板前应将培养基摇匀，防止在瓶底有沉淀。但是摇倾倒平板前应将培养基摇匀，防止在瓶底有沉淀。但是摇动时要防止产生大量气泡。动时要防止产生大量气泡。通常条件下平板制备好后室温放置或温箱放置通常条件下平板制备好后室温放置或温箱放置23天使用，天使用，目的：一可以检查培养基是否灭菌彻底，是否在倾倒过程目的：一可以检查培养基是否灭菌彻底，是否在倾倒过程被微生物污染；二为了使平板表面干湿适宜，防止菌落由被微生物污染；二为了使平板表面干湿适宜，防止菌落由于平板上的水滴运动而连片以致无法计数。于平板上的水滴运动而连片以致无法计数。检测前的准备检测前的准备检测前的准备检测前的准备（二）操作过程（二）操作过程l2.1 母液制备l2.2 系列稀释、加样和涂布l2.3 培养l2.4 识别和计数2.1 母液（基础液）的制备母液（基础液）的制备样品混合均匀：样品混合均匀：很重要很重要固体样品：称取固体样品：称取10g左右样品加入到左右样品加入到100mL无无菌水（菌水（ 500mL三角瓶）中，静置三角瓶）中，静置20min。液体样品：量取液体样品：量取10.0ml样品加入到样品加入到90mL无菌水无菌水（500mL三角瓶）中，静置三角瓶）中，静置20min 。分散菌体：将三角瓶置于摇床上分散菌体：将三角瓶置于摇床上200r/min振荡振荡30min，即成母液菌悬液。即成母液菌悬液。2.2 样品稀释、加样和涂布样品稀释、加样和涂布准备工作：准备工作： 应将平板上做好标记，包括培养基种类，样品应将平板上做好标记，包括培养基种类，样品编号，稀释度编号，稀释度/稀释倍数稀释倍数. 将小瓶无菌水写好样品编号、稀释度将小瓶无菌水写好样品编号、稀释度/稀释倍数稀释倍数具体过程见具体过程见GB20287-2006 农用微生物菌剂农用微生物菌剂2.2.1 系列稀释系列稀释 用无菌吸管分别吸取用无菌吸管分别吸取 5.0mL 上述母液菌悬液加上述母液菌悬液加至至45 mL无菌水（无菌水（150mL三角瓶）中，按三角瓶）中，按1:10(10倍倍)进行依次稀释，分别得到进行依次稀释，分别得到10-1，10-2 ，10-3 ，10-4等浓度的菌悬液（每个稀释度应更换无菌吸管）等浓度的菌悬液（每个稀释度应更换无菌吸管） 注：稀释度：注：稀释度：10-1，10-2 ，10-3 ，10-4 ，10-5 相当于相当于 稀释倍数：稀释倍数：101， 102 ， 103 ，104 ，105 2.2.2 加样和涂布加样和涂布 每个样品取每个样品取3个连续适宜稀释度，用个连续适宜稀释度，用0.5mL无菌无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至预先，加至预先制好的固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将制好的固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度的菌悬液均匀地涂于平板表面。不同稀释度的菌悬液均匀地涂于平板表面。 每一稀释度每种培养基做每一稀释度每种培养基做3个重复，同时以无菌个重复，同时以无菌水作空白对照。水作空白对照。稀释、加样和涂布注意事项稀释、加样和涂布注意事项1.整个程序应在无菌间或超净台内进行，操作人员时刻有整个程序应在无菌间或超净台内进行，操作人员时刻有无菌概念无菌概念2.适宜稀释度：根据标准或企业提供的信息选择稀释度。适宜稀释度：根据标准或企业提供的信息选择稀释度。3.系列稀释时不同的稀释度应更换吸管（移液管），加样系列稀释时不同的稀释度应更换吸管（移液管），加样和涂布不同稀释度时也要更换吸管和刮刀。和涂布不同稀释度时也要更换吸管和刮刀。4.每个培养皿均要标明培养基种类、样品编号、稀释度每个培养皿均要标明培养基种类、样品编号、稀释度5.稀释和加样要准确，涂布均匀及时，使用的吸管量程要稀释和加样要准确，涂布均匀及时，使用的吸管量程要适宜。适宜。6.无菌水对照，以检查吸管、刮刀以及稀释用水灭菌是否无菌水对照，以检查吸管、刮刀以及稀释用水灭菌是否彻底、操作过程是否合乎无菌要求。彻底、操作过程是否合乎无菌要求。2.3 平板的培养平板的培养将涂布好平板放在适宜的条件下培养将涂布好平板放在适宜的条件下培养 如：如： 温度条件温度条件 气体条件气体条件 培养时间培养时间 平板倒置培养平板倒置培养2.4 菌落识别和计数菌落识别和计数1.通过菌落识别、涂片染色、镜检观察，确定通过菌落识别、涂片染色、镜检观察，确定有效菌。有效菌。（必要时做生化实验）（必要时做生化实验）2.选择性培养基上长出的菌落并非都是有效菌，选择性培养基上长出的菌落并非都是有效菌，培养基的选择性是相对的。培养基的选择性是相对的。3.一种有效菌只在一种特定培养基上计数，不一种有效菌只在一种特定培养基上计数，不同培养基上同一种有效菌不能累加。同培养基上同一种有效菌不能累加。4.细菌杂菌（包括放线菌）在培养细菌的培养细菌杂菌（包括放线菌）在培养细菌的培养基上计数；霉菌和真菌杂菌在真菌培养基上基上计数；霉菌和真菌杂菌在真菌培养基上计数。但也不能重复计数。计数。但也不能重复计数。（三）计算（三）计算l3.1 有效稀释度的选择有效稀释度的选择l3.2 标准差标准差l3.3 计算公式及示例计算公式及示例3.1 有效稀释度的选择有效稀释度的选择参见标准参见标准 GB20287-2006的的6.3.2.4示例：（表格）示例：（表格）计数原则计数原则以出现以出现20300个细菌菌落数的稀释度的平板为计数标准，个细菌菌落数的稀释度的平板为计数标准，丝状真菌为丝状真菌为10150个菌落数。个菌落数。 当只有一个稀释度，其平均菌落数在当只有一个稀释度，其平均菌落数在20300之间时，之间时，则以平均菌落数计算。则以平均菌落数计算。 若有两个稀释度，其平均菌落数均在若有两个稀释度，其平均菌落数均在20300之间时，之间时，应按两者菌落总数之比值决定：应按两者菌落总数之比值决定： 若其比值小于等于若其比值小于等于2应计算两者的平均数；应计算两者的平均数； 若大于若大于2则以稀释倍数小的菌落平均数计算。则以稀释倍数小的菌落平均数计算。例次例次不同稀不同稀释释倍数的倍数的菌落平均数菌落平均数两个稀两个稀释释倍数倍数度菌落度菌落数之比数之比菌数菌数亿亿/g,mL1031041051无法数无法数无法数无法数253/25.32无法数无法数31532/3.23313383/0.3842893221.10.305无法数无法数136342.5/63250/0.03271530/0.0153.2 标准差标准差(Standard Deviation) ：各数据偏离平均数的距离（离均差）的平均数，它是离差平方和平均后的方根。用表示。标准差体现随机变量取值与其期望值的偏差。标准标准 NY411-2000 固氮菌肥料的固氮菌肥料的7.2.6.2。平板上菌落数对应的标准差要求平板上菌落数对应的标准差要求平板上菌落平板上菌落平均数，个平均数，个/皿皿20-5051-99100-300标准差标准差10.020.050.0标准差分析（例子）标准差分析（例子）重复重复I重复重复II重复重复III平均数平均数标准差标准差3548219100.7102.73.3 有效活菌数和杂菌的计算有效活菌数和杂菌的计算示例l样品编号 ：Al样品状态：颗粒l执行标准：GB20287-2006l菌种名称：巨大芽孢杆菌l称样量：10.10g重复重复稀稀释释倍数倍数（巨大芽（巨大芽孢孢杆菌在杆菌在营营养肉养肉汤汤培养基上）培养基上）/1031041051无法数无法数11515有效菌有效菌数数亿亿/g2无法数无法数126193无法数无法数12417菌落菌落平均平均数数/121.717.01.20标准标准差差/5.9/重复重复稀稀释释倍数倍数（细菌细菌杂杂菌在菌在营营养肉养肉汤汤培养基上）培养基上）/1031041051无法数无法数152杂杂菌数菌数亿亿/g2无法数无法数2543无法数无法数183菌落菌落平均数平均数/19.3/0.19重复重复稀稀释释倍数倍数（霉菌在（霉菌在马马丁培养基丁培养基上）上）/10310410516/霉菌数霉菌数个个/g27/38/菌落菌落平均数平均数7.0/0.69106重复重复稀稀释释倍数倍数（真菌（真菌杂杂菌在菌在马马丁培养丁培养基上，不包括霉菌）基上，不包括霉菌）/10310410513/真菌真菌杂杂菌菌亿亿/g22/34/菌落菌落平均数平均数3.0/0.0030样品编号检测日期年 月 日室温，相对湿度，%仪器名称、编号1.培养箱 2.洁净室菌种名称依据标准培养温度， 培 养 基培养时间， h 基础液体积v1，mL 样品量m0(v0)，g(mL) 加 样 量v2，mL 稀释倍数 k菌 落 数(cfu /皿)重复重复重复平均 标准差n-1无菌水对照计算公式： nm = 10-8kv1/(m0v2) 其中nm为质量有效活菌数或 nv = 10-8kv1/(v0v2) 其中nv为体积有效活菌数 计算结果： 亿/g(mL)备 注：检测人校核人审核人有效活菌数测定原始记录表有效活菌数测定原始记录表样品编号检测日期年 月 日室温，相对湿度，%仪器名称、编号1.培养箱 2.洁净室依据标准 基础液体积v1，mL 样 品 量m0 (v0)，g(mL)加样量v2 ，mL培养基1. 培养温度，1.培养时间，h1.2.2.2.真菌杂菌细菌杂菌类别稀释倍数k1，k2菌 落 数（cfu /皿）稀释倍数k3菌 落 数（ cfu /皿）重复I重复II重复III平均重复I重复II重复III平均霉菌其他真菌无菌水对照无菌水对照真菌杂菌数霉菌杂菌数n1 /g(mL)细菌杂菌数n3亿/g(mL)其他真菌数n2/g(mL)k3v1/(v0 v2)有效活菌数nm (nv)亿/g(mL)杂菌率 R %计算公式：R = 100(10-8n1+10-8n2+n3)/( 10-8n1+10-8n2+n3+nm) 或 R = 100(10-8n1+10-8n2+n3)/( 10-8n1+10-8n2+n3+nv)备 注：检测人校核人审核人杂菌测定原始记录表杂菌测定原始记录表结果判定（示例）l标准要求 产品测定结果l有效菌数： 2.0 亿/g 1.20 亿/g l霉菌数： 3.0 106个/g 0. 69 106个/g l杂菌率： 30.0 % 14.28 %l结论：该样品的l 有效菌数不合格；l 霉菌数和杂菌率合格。回顾关键点培养前的准备样品制备、稀释、涂布、培养有效菌和杂菌的确认计算