1水产动物组织切片的制作与染色水产动物组织切片的制作与染色2一、实验目的一、实验目的n学习石蜡切片法学习石蜡切片法n了解组织染色原理了解组织染色原理n掌握各组织器官的基本结构掌握各组织器官的基本结构3组织切片标本组织切片标本载玻片载玻片盖玻片盖玻片组织组织二、实验原理二、实验原理4二、实验原理二、实验原理n n取材取材n n固定固定n n脱水脱水n n透明透明n n浸蜡浸蜡n n包埋包埋n n切片切片n n染色染色n n封片封片51.1.取材取材 根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、新鲜、准确、完整准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。，材料要避免挤压、挫伤、干枯。n种类：种类：n部位：部位：肝肝n年龄或发育阶段年龄或发育阶段n是观察横切面还是纵切面？是观察横切面还是纵切面？取材原则：取材原则：n动作动作-快，轻，用力均匀快，轻，用力均匀n体积合适：体积合适： 0.30.30.3 cmn刀要锋利刀要锋利n及时固定及时固定:编号编号, 注明采集时间、地点、名称、组织部位注明采集时间、地点、名称、组织部位62.2.固定固定 取材后应及时固定，取材后应及时固定，编号，注明采集时间、地点、编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位。名称、组织部位。n目的目的-保持原来的结构保持原来的结构n固定液：固定液：波恩氏液波恩氏液n固定时间：固定时间：48h左右左右n固定后的处理：固定后的处理：将固定液换成将固定液换成70%乙醇作短期保存乙醇作短期保存7n单一固定液单一固定液n复合固定液复合固定液长处突出，短处抵消长处突出，短处抵消（Bouins） 8固定组织时应注意：固定组织时应注意：固定组织时应注意：固定组织时应注意：n保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。n固定液必须有足够的量，一般大于组织固定液必须有足够的量，一般大于组织2020倍以上。倍以上。n组织块不易过大过厚，厚度必须控制在组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm0.3cm以内。以内。n冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。人为假象。n抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的干扰。干扰。9p水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。现采用的脱水剂一般是透明剂进入。现采用的脱水剂一般是乙醇乙醇或丙酮。或丙酮。它既能与水相混合，又能与透明剂相混。它既能与水相混合，又能与透明剂相混。p脱水的过程：脱水的过程：70%80%90%70%80%90%（各（各1h1h） 95%95% 95%95%100%100%100%100%（各（各20min20min）p脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。p保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，但不能过度脱水（过久使组织变脆但不能过度脱水（过久使组织变脆, , 收缩）收缩）3.3.脱水脱水104. 4. 透明透明p二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是是易使组织收缩，变硬，变脆易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。根据组织块大小及质地酌情而定。p替代品：替代品：水杨酸甲酯（水杨酸甲酯（30min），氯仿等。，氯仿等。11p将将完完成成透透明明步步骤骤的的组组织织块块浸浸入入透透明明剂剂与与石石蜡蜡混混合合液液中中，不不断断提提高高石石蜡蜡的的比比例例，直直至至用用石石蜡蜡完完全全置置换换了了组组织织块块中中的的透透明明剂剂，使使石石蜡蜡浸浸入入组组织织而而起起支支持作用，便于今后的包理与切片（持作用，便于今后的包理与切片（1h1h）。）。p浸浸蜡蜡应应在在高高于于石石蜡蜡熔熔点点33左左右右的的温温箱箱（6060）中中进行，以利石蜡浸入组织内。进行，以利石蜡浸入组织内。5. 浸蜡浸蜡12p将液态石蜡缓缓倒入将液态石蜡缓缓倒入金属模具金属模具中，再用镊子中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入轻轻将浸好蜡的组织块夹入金属模具金属模具，摆好，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕（位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕（约约15 15 minmin）。）。6. 包埋包埋137.切片切片n包埋好的蜡块用刀片修包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，成规整的方形或长方形，附于小木块上附于小木块上n通常切片厚度为通常切片厚度为5 56um6um切切出一片接一片的蜡带，用出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。毛笔轻托轻放在纸上。14贴片与烤片贴片与烤片n用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后操作中使材料脱落。以后操作中使材料脱落。n在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入4545温箱中干燥。温箱中干燥。158. 染色染色（H.E）碱性染料，使细胞核等呈碱性染料，使细胞核等呈紫蓝色紫蓝色嗜碱性嗜碱性酸性染料，使一般胞质和胶酸性染料，使一般胞质和胶原纤维呈粉红色原纤维呈粉红色 嗜酸性嗜酸性苏木精（苏木精（hematoxylin）伊红（伊红（eosin）16染色液配制染色液配制179. 封片封片n染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在酒精脱水，在9595及纯酒精中的时间可适当加长及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。在酒精中的时间，以免脱色。n二甲苯透明后，滴加适量（二甲苯透明后，滴加适量（1 12 2滴）中性树胶，滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡。再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡。18三、实验主要仪器三、实验主要仪器切片机烤片机摊片机19四、实验试剂四、实验试剂nBouin氏氏液液：饱饱和和苦苦味味酸酸 75 ml,甲甲醛醛 25 ml，冰冰乙乙酸酸 5 ml。nEhrilich氏氏酸酸性性苏苏木木素素液液：苏苏木木素素 2 g，纯纯酒酒精精 100 ml，钾钾明明矾矾 15 g，蒸蒸馏馏水水 100 ml，甘甘油油 100 ml，冰冰醋醋酸酸 10 mln1%伊红染液伊红染液：中性曙红：中性曙红 0.51 g，蒸馏水，蒸馏水 100 ml n1%盐盐酸酸-酒酒精精分分化化液液：浓浓盐盐酸酸 1 ml，70%酒酒精精 99 ml 。n梯梯度度酒酒精精：70%乙乙醇醇、80%乙乙醇醇、90%乙乙醇醇、95%乙乙醇、无水乙醇。醇、无水乙醇。n二甲苯二甲苯n石蜡石蜡n中性树胶中性树胶20五、实验步骤五、实验步骤（1）取材）取材21n取材取材固定固定（24-36 h）n70%乙醇（乙醇（1 h）n80%乙醇（乙醇（1 h）n90%乙醇（乙醇（1 h）n95%乙醇乙醇（20min*2）n100%乙醇乙醇（20min*2）n水杨酸甲酯水杨酸甲酯（约（约30min ）n1/2石蜡石蜡 + 1/2二甲二甲苯（苯（20min）n蜡杯蜡杯 （20min*2）n包埋包埋n切片切片n贴片贴片n烤片烤片（2）脱水、透明、浸蜡、包埋、切片）脱水、透明、浸蜡、包埋、切片22（3）H.E.染色流程染色流程n二甲苯二甲苯脱蜡脱蜡（1）（）（10 min）n二甲苯脱蜡二甲苯脱蜡(2)（5 min）n1/2 100%乙醇乙醇 + 1/2 二甲二甲苯（苯（1）（）（3 min）n100%乙醇（乙醇（2 min）n95%乙醇（乙醇（2 min）n80%乙醇（乙醇（2 min）n70%乙醇（乙醇（2 min）n蒸馏水洗（蒸馏水洗（3 min）吸水吸水n苏木精染色苏木精染色（14min）n自来水洗（自来水洗（10min）n分化液分化液分化分化（3s）n自来水洗（自来水洗（35 min）n伊红染色伊红染色（1.5min）n70%乙醇乙醇 （2 min）n80%乙醇（乙醇（2 min）n 90%乙醇（乙醇（2 min）n95%乙醇乙醇 (1)(2)（2 min）n100%乙醇乙醇(1)(2) （2 min）n二甲苯二甲苯(1)(2) （3min）n中性树胶中性树胶封片封片n显微镜观察显微镜观察23六、结果分析六、结果分析- -切片的观察切片的观察要求：要求：n各小组将固定的组织切片图拍照，并标出各小组将固定的组织切片图拍照，并标出图中的结构名称。图中的结构名称。n各组提交一张认为制作较好的玻片。各组提交一张认为制作较好的玻片。