生物电子显微技术生物电子显微技术 第二章第二章透射电镜的结构与成像原理透射电镜的结构与成像原理生物电子显微技术生物电子显微技术第一节第一节 透射电镜的结构透射电镜的结构一、电子光学系统一、电子光学系统二、真空系统二、真空系统三、供电系统三、供电系统( (电子学系统电子学系统) )生物电子显微技术生物电子显微技术 电子光学系统 真空系统 供电系统三大部分TEMTEM的基本构造的基本构造生物电子显微技术生物电子显微技术 电镜的组成(一）生物电子显微技术生物电子显微技术电镜的组成（二）电镜的组成（二）生物电子显微技术生物电子显微技术高压电缆电子枪室第一、二聚光镜 光阑样品臂物镜中间镜投影镜观察窗荧光板底片盒TEM剖面图观察室生物电子显微技术生物电子显微技术（一）、电子枪 1、电子枪结构 1) 自给偏压式三极电子枪 阴极：尖端发射电子 栅极：控制电子束形状和发射强度 阳极：加速电子、调节电子波长一、一、 电子光学系统电子光学系统生物电子显微技术生物电子显微技术 电子枪典型结构的主要部件图生物电子显微技术生物电子显微技术电子束形成示意图生物电子显微技术生物电子显微技术灯丝加热温度和发射电流之间的关系TI生物电子显微技术生物电子显微技术1、电子枪结构、电子枪结构2) 场发射电子枪阴极：钨丝针尖阴极，其曲率半径10002000。第一阳极：相对于阴极有一正压，引发阴极场发射并控制发射电流强度。第二阳极：加速电子、调节电子波长生物电子显微技术生物电子显微技术场发射式电子枪场发射式电子枪生物电子显微技术生物电子显微技术名词名词： 场发射场发射：在金属表面加上极强的电场之后，金属：在金属表面加上极强的电场之后，金属表面势垒降低表面势垒降低,在隧道效应的作用下，金属内部的在隧道效应的作用下，金属内部的自由电子穿过势垒从金属表面发射出来，向真空飞自由电子穿过势垒从金属表面发射出来，向真空飞去，这种物理现象称为场发射去，这种物理现象称为场发射 场发射电子枪特点场发射电子枪特点：亮度高；交叉光斑小，直径1 m，最小30100；能量分散小；寿命长，给定寿命2000小时（实际可用3年左右）；分辨率高，高分辨率的TEM和SEM都采用。生物电子显微技术生物电子显微技术 1). 钨丝阴极：热电子发射, 最小交叉斑直径 1050m , 寿命2025h,最长约200h 2). LaB6阴极：低温热电子发射亮度高, 寿命约 1000h 2、电子枪从材料可以分为：生物电子显微技术生物电子显微技术1、磁透镜的汇聚作用2、汇聚作用结论：磁透镜总是汇聚透镜磁场稍有变化，焦距f则有较大变化,磁场强度越强焦距越短透镜的放大倍数越高。（焦度1/fHz2)，且电子加速电压越高，电子速度越快，电子越不被易折射，焦距f就越长(二)、磁电子透镜生物电子显微技术生物电子显微技术Hr：磁场：磁场强度的径向强度的径向分量分量Hz：轴：轴向分量向分量1-3rFzr生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术几何光学作图法几何光学作图法生物电子显微技术生物电子显微技术1). 聚光镜聚光镜 ：汇聚电子束，控制束斑的大小 控制孔径角第一级聚光镜C1：短焦距强磁透镜第二级聚光镜C2：长焦距弱磁透镜 2). 物镜物镜作用：形成样品第一级放大的像; 改变其焦距f，对象进行精确聚焦.类型：短焦距强磁透镜3、TEM的磁透镜生物电子显微技术生物电子显微技术3).与物镜相关的装置与物镜相关的装置 A.物镜极靴 保证磁场的轴对称，防止磁饱和,减少磁场能量的浪费B.物镜可动光阑 30，50，70 m 控制物镜孔径角、减小球差 、增强像的反差C.物镜消像散器 消除像散，提高物镜分辨率D.物镜的散热装置 维持物镜低恒温，减少物镜热漂移30，50，70 m生物电子显微技术生物电子显微技术电子束极靴电磁线圈电磁线圈物镜极靴纵面图生物电子显微技术生物电子显微技术带极靴的磁透镜生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术4). 中间镜和投影镜中间镜和投影镜 中间镜中间镜 类型：长焦距弱透镜类型：长焦距弱透镜 倍率可变倍率可变 M20， 可设二级可设二级 作用：第二次放大图象、控制总放大倍数作用：第二次放大图象、控制总放大倍数 投影镜投影镜 类型：类型： 短焦距强透镜，可设二级短焦距强透镜，可设二级 作用：第三次放大图象作用：第三次放大图象 生物电子显微技术生物电子显微技术总放大倍数：M总=MO MI MP其中：MO：物镜放大倍数MI ：中间镜放大倍数MP：投影镜放大倍数 物 镜：Objective Lens (OL) 中间镜：Intermediate Lens (IL) 投影镜：Projector Lens (PL)生物电子显微技术生物电子显微技术物镜100X样品第一级实像中间镜20X第二级实像最终像投影镜100X生物电子显微技术生物电子显微技术1）位置：聚光镜和物镜之间2）作用：更换样品，承载样品，移动样品3）组成：样品载体，样品架，样品台，样品移动机构，空气闭锁装置，防污染装置4）结构分类： 顶落式顶落式：样品台在物镜激励线圈上方，样品架由上而下落入物镜中，稳定度高，可以获得高分辨率图像。 侧插式侧插式：样品台在物镜激励线圈下方，样品架由上侧面进入物镜中，结构复杂可以获得最短物镜焦距，常采用（三）、样品室（三）、样品室生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术防污染装置冷阱铜块（-100-150C）样品入射电子空心圆孔生物电子显微技术生物电子显微技术观察装置荧光板 （5070nm),散射反差为主散射反差为主小结构小结构:（t50nm),位相反差为主位相反差为主特小结构特小结构:（d1nm,t10nm),唯一的反差：唯一的反差： 位相反差位相反差生物电子显微技术生物电子显微技术4、提高反差的方法、提高反差的方法 操作电镜操作电镜缩小孔径角降低加速电压暗场观察离焦反差 其中： （由卢瑟福散射定律推出） DN/N ：被光阑挡掉的电子的机率 Z ：原子序数 e：电子电量 ：孔径角 V： 电子加速电压 M：样品原子量 N0：阿伏伽德罗常数生物电子显微技术生物电子显微技术 dN/N=C*t 即t dN/N 从比较大的t值与很小的t值间, t越大, 结论结论: dN/N越大,像的反差越强dN/N=10dN/N=5dN/N=1反差大反差小生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术同理可得:越小，C越大， t稍有变化，dN/N就有很大变化，即 dN/N越大、像的反差增大V越小，像的反差增大 暗场观察b,c暗场照明生物电子显微技术生物电子显微技术离焦反差 费涅耳环（条纹）： 当光照射到一个障碍物边缘时，在该边缘会产生一个次级波， 它与入射波发生干涉作用，在障碍物的边缘处产生明暗相间 的干涉条纹。 生物电子显微技术生物电子显微技术 费涅耳环： 欠焦时 亮线 过焦时 暗线 正焦时 消失 故正焦时故正焦时 图象的反差最小图象的反差最小生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术 提高样品本身的质量厚度差别提高样品本身的质量厚度差别 电子染色正染色，负染色超薄切片染色原则: 生物样品不同区域不同组份对重金属离子的结合力不同,t越大,结合重金属离子越多; 金属投影 增加厚度（f1时： AB面正焦，CD欠：CD正，AB欠 分类分类：残余像散（用消像散器消除）， 二次像散（清洗） 消像散器消像散器的工作原理：在透镜磁场中，用消散 仪产生一个弱的柱面磁场，并调节它，使之与要校正的像散大小相等、方向相反，从而抵消残余像散。生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术畸变畸变：由于透镜边缘部分比中心部分的聚焦能力强， 致使物体上各点像的放大倍数，随着物点离轴 的径向距离的不同而变化 畸变程度： (Rd)=CdR03 分类：桶形畸变：Cd0,离轴越远，物点放大倍数旋转畸变：由于球差的存在使电子束角度随着 离轴距离而变化扭曲畸变： （桶或枕）旋转 注： 畸变只是像的比例失调，图像是清楚的生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术 色差色差： （波长差） 定义定义：由于电镜加速电压波动导致电子束波长发 生变化，使得入射电子速度不一致，与速度 相应的电子波长也有一定的分散度，从而引 起的一种像差。 原理原理： V， ， 电子越不易折射，焦距f大 V ， ， ，电子越易折射，焦距f小 同理： （光镜） 红光偏折最小，红光焦长 紫光偏折最大，紫光焦短 分类分类： 中心色差，放大色差，旋转色差， 放大旋转色差生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术 形成色差的原因：形成色差的原因： f =Cc(V/V- 2I/I) 式中: f:焦差； Cc：色差系数 V/V：加速电压相对起伏 I/I：透镜激励电流相对起伏加速电压的变化透镜激励电流变化电子与样品的交互作用 减小色差的方法：减小色差的方法：稳定加速电压和透镜激励电流106min，减小光阑直径（即孔径角）样品做薄，提高加速电压，使电子穿过样品的速度变化小。采用电子速度过滤器，减少参与成像电子速度分布生物电子显微技术生物电子显微技术C. TEM最佳分辨率最佳分辨率 电镜的分辨率主要取决于物镜的分辨率 物镜的分辨率取决于：衍射差：d0.61/nsin=0.61 / 球差: sCs3色差、像散：可以忽略 只考虑衍射差和球差的综合效应 最佳1.1(/ Cs)1/4 opt=0.65(Cs 3) 最佳=0.2nm生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术 实际 (s2+ d2+ a2+ c2)1/2 一般TEM0.51nm（二）（二） 有效放大倍数：有效放大倍数：植物细胞直径100m动物细胞1020 m细菌的直径1 m病毒直径10100nm生物大分子110nm小分子0.11nm原子直径0.1nm M有效 肉眼仪器生物电子显微技术生物电子显微技术二二 透射电镜的其它性能指标透射电镜的其它性能指标1. 场深：也称景深，指在保持像清晰度的条件下，物面允 许移动的距离。 Dfi=/ 特点：场深大, 可达1 m 容易聚焦，物面位置允许有Dfi长度的误差 对于厚度小于场深的样品，都能获得高分辨率 图像，尤其适合复型样品；但同时也导致图像 上下叠加背底昏暗2. 焦深：在保持像清晰度的条件下,像面许移动的距离 Dfo=M2* Dfi 特点：焦深大,M=500时，500m，最大可达10000m 照相时非常方便 生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术生物电子显微技术三三 适用于透射电镜的样品适用于透射电镜的样品 1. 从样品类别上分：超薄切片冷冻蚀刻的复型膜悬浮样品的滴片直接培养的单层细胞 2. 从研究内容上分免疫电子显微技术电镜放射自显影技术电镜细胞化学技术Xray微区分析生物电子显微技术生物电子显微技术 免疫电子显微镜技术的定义：免疫电子显微镜技术的定义：(Immune Electron Microscopy: IEM)又又叫免疫电镜细胞化学技术，就是将免疫化学技叫免疫电镜细胞化学技术，就是将免疫化学技术与电镜技术有机地结合起来，研究抗原抗体术与电镜技术有机地结合起来，研究抗原抗体相互作用的一种方法。抗原抗体之间的相互作相互作用的一种方法。抗原抗体之间的相互作用具有较高的特异性，相互作用后，可直接形用具有较高的特异性，相互作用后，可直接形成或通过某种标记物形成大分子复合物或聚合成或通过某种标记物形成大分子复合物或聚合物。该生成物具有电子致密性，在电镜下可以物。该生成物具有电子致密性，在电镜下可以观察到，又不影响免疫反应的特异性。那么，观察到，又不影响免疫反应的特异性。那么，就可以在细胞超微结构水平上或分子水平上研就可以在细胞超微结构水平上或分子水平上研究免疫作用。这种在很高分辨本领电镜下非常究免疫作用。这种在很高分辨本领电镜下非常精确地显示抗原所在位置的方法称为精确地显示抗原所在位置的方法称为 生物电子显微技术生物电子显微技术免疫电子显微镜技术的免疫电子显微镜技术的原理：原理：用化学方法将不同大小的金粒与特异性抗体球蛋白在不影响特异性蛋白质免疫特性的前提下结合起来，制备成金标抗体(GA)。当GA与相应的抗原(直接法)或抗原抗体复合物(间接法)相遇时，即结合形成免疫金复合物，可用透射电镜观察反应结果：有金粒的地方，即为抗原或抗原抗复合物存在的地方。不同抗原肽以不同种动物供体来的相应标记抗体顺序反应，可在同一组织切片中标记两种抗原肽。抗体以小金粒标记，另一抗体以大金粒标记，在透射电镜下很容易将两者区分开来。 两种抗原肽分别与来自不同种动物供体的抗体发生反应，兔初抗用小粒金标记的猪抗兔IgG检测；而豚鼠初抗IgG用大粒金标记的兔抗豚鼠IgG检测。生物电子显微技术生物电子显微技术举例：举例：验证植物的胞间连丝组分中，是否有actin（肌动蛋白）和 myosin（肌球蛋白）的存在。生物电子显微技术生物电子显微技术VAP (6-nm gold particles) and MP (18-nm gold particles)A coiled-coil interaction mediates cauliflower mosaic virus cell-to-cell movementLivia Stavolone, Maria Elena Villani, Denis Leclerc, and Thomas HohnPNAS April 26, 2005 vol. 102 no. 17 62196224生物电子显微技术生物电子显微技术作业作业1. 名词解释：分辨率 振幅差 场深 焦深2.透射电镜主要由哪三大系统组成?其中每个 系统主要包括哪些部分?3. 透射电镜工作时为什么要求真空?4. 电子束与样品相互作用后产生哪些信息?其中又有哪些信息与透射电镜的成像有关？5. 生物样品的反差有什么特点? 怎样提高生物样品的反差6. 简述透射电镜的基本成像过程。7. 透射电镜有哪些主要性能。生物电子显微技术生物电子显微技术透射电镜有哪些主要性能： TEM是以电子束作为照明光源的；装有聚光镜、物镜、中间镜、投影镜一系列电磁透镜；其分辨率可达0.10.2nm;有效放大倍数可达100万左右；散射反差和位相反差在其成像反差起主导作用；在放大500倍时其焦深为500 m，场深可达1 m ；图象用荧光板显示，且无色彩；适于100nm的超薄切片、复型膜等；要求样品在真空条件下成像。