荧光荧光PCRPCR系列产品系列产品 操作培训操作培训 一、实时荧光一、实时荧光PCRPCR平台简介平台简介二、荧光二、荧光PCRPCR系列产品操作细节系列产品操作细节三、荧光三、荧光PCRPCR异常结果分析异常结果分析一、实时荧光PCR平台简介传统传统PCR & 实时荧光实时荧光PCR实时荧光实时荧光PCR 常用荧光标记常用荧光标记u荧光染料光染料SYBR Green ISyto 9u荧光探光探针TaqManTaqMan-MGBTaqManTaqMan水解探针作用机理水解探针作用机理探针与目标序列配对探针与目标序列配对光光能量转移Taq游离的探针，无荧光游离的探针，无荧光。荧光基团 荧光淬灭基团 延伸时，延伸时，TaqTaq酶水解探针，使报告基酶水解探针，使报告基团和淬灭基团分离而发出荧光，形团和淬灭基团分离而发出荧光，形成荧光信号。成荧光信号。Taq发出荧光光实时荧光实时荧光PCR 实验原理实验原理v采用特异性引物，结合特异性的采用特异性引物，结合特异性的TaqManTaqMan荧光标记探针技荧光标记探针技术，通过荧光术，通过荧光PCRPCR仪，进行仪，进行同步同步核酸扩增与检测。核酸扩增与检测。 扩增曲线扩增曲线 四个阶段四个阶段基基线 阈值 Ct值 【DNA】0v基线：扩增曲线的水平部分基线：扩增曲线的水平部分v基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的v默认前15个循环信号作为荧光本底信号 对数图谱线性图谱基基线 阈值 Ct值 【DNA】0v默认阈值默认阈值= =基线（背景）信号标准偏差基线（背景）信号标准偏差 10v缺省设置：3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍v手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值（进入指数期的最初阶段）基基线 阈值 Ct值 【DNA】0vCtCt值：值：每个样本荧光信号到达设定域值时所经历的循环数每个样本荧光信号到达设定域值时所经历的循环数基基线 阈值 Ct值 【DNA】0v每个样本的每个样本的CtCt值与该样本的起始拷贝数（值与该样本的起始拷贝数（【DNA】0）的）的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CtCt值越小。值越小。起点定量起点定量 & 终点定量点定量v起始DNA量：样本中原有的量，更有意义；v终点DNA量：经PCR过程加工，不是研究所需要的数据；v起点定量误差小，终点定量误差大。起点定量误差小，终点定量误差大。二、荧光PCR系列产品操作细节HPV系列系列产品品v1313种高危型种高危型HPVHPV检测试剂盒检测试剂盒 （HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68） 不分型不分型v1414种高危型种高危型HPVHPV检测试剂盒检测试剂盒 （HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68） 对对HPV16、18分型分型样本本类型型&采集方法采集方法v宫颈脱落细胞宫颈脱落细胞 用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处宫颈脱落细胞。v男性尿道标本男性尿道标本 用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检（采集标本前2小时禁小便）。v男女性疣体标本男女性疣体标本 既可以直接切下疣体组织放进无菌玻璃管内，又可以用一次性注射器把疣体刺破后再用棉拭子反复擦拭病灶处脱落细胞置入无菌玻璃管，密闭送检。v特殊样本特殊样本 TCT采集系统样本采集系统样本：可以使用，但可根据所剩细胞浓度 竞品采样系统样本竞品采样系统样本：亚能、港龙等采样系统样本均可用，HC2采样系统要确保未经过处理方可使用采采样前注意事前注意事项不可在不可在碘试验和醋酸试验碘试验和醋酸试验之后采集样本。之后采集样本。 （可能会抑制（可能会抑制PCR反应）反应）检查前检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物药物。 （可能会造成假阴性）（可能会造成假阴性） （可能会抑制（可能会抑制PCR反应）反应）检查前检查前48小时不应有小时不应有性生活性生活。（可能会造成假阳性）（可能会造成假阳性）月经期月经期不可采集标本。不可采集标本。（防止血液过多，可能会抑制（防止血液过多，可能会抑制PCR反应）反应）注意避免注意避免交叉污染交叉污染。（可能会造成假阳性）（可能会造成假阳性）样本保存本保存样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱箱44存放，并在一周时间内检测。应避免反复冻融。存放，并在一周时间内检测。应避免反复冻融。一周后检测的标本应保存在一周后检测的标本应保存在一周后检测的标本应保存在一周后检测的标本应保存在-20-20-20-20 。DNA提取提取 取取800ul800ul样本离心得沉淀样本离心得沉淀 加入细胞裂解液加入细胞裂解液50ul50ul，煮沸，煮沸10min10min 12000 12000离心离心10min10min即可上机即可上机若肉眼未见沉淀，可增加取样量，再次离心收集沉淀；若沉淀杂质较多，可用细胞保存液洗涤1-2次；血液多样本，用蒸馏水洗涤1-2次；粘液多样本，取样时尽量去除粘液。应注意防止爆盖：金属浴可压重物（冰盒、冰袋等）水浴应采用螺旋管盖的离心管确保离心管质量合格优点优点：简单、快捷、方便。：简单、快捷、方便。缺点缺点：HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。抑制剂。v针对男性样本或女性疣体样本（棉拭子样本）（棉拭子样本），先用细胞保存液/生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致DNA质量要求质量要求v匹基、匹基、达安等都是使用直接煮沸法提取的达安等都是使用直接煮沸法提取的DNADNA， 可直接使用可直接使用v使用过柱法试剂盒，比如使用过柱法试剂盒，比如QIAGENEQIAGENE提取的提取的DNADNA，也可以使用也可以使用PCR试剂配制试剂配制HPV13荧光荧光 PCR MIX（l） Taq 酶（酶（l） DNA 模板（模板（l）1人份量 17.5 0.5 2/人份10人份量 1755 2/人份HPV12+2 PCR MIX（l） Taq 酶（酶（l） DNA 模板（模板（l）1人份量 17.5 0.5 2/人份10人份量 175 5 2/人份v按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装对照设置对照设置u定性定性试验 每次试验都必须设置阴阳性对照每次试验都必须设置阴阳性对照u定量定量试验 个别医院要求定量结果，需增加标准品个别医院要求定量结果，需增加标准品（105105、106106、107107、108108 copiescopies） 标准品一般可以反复冻融标准品一般可以反复冻融3-43-4次，超过次，超过5 5次，则不建议使用次，则不建议使用 标准品置于标准品置于-20-20中保存中保存操作注意事项操作注意事项uPCR试剂保存配制保存配制PCRPCR试剂应放于试剂应放于-20-20避光保存避光保存PCRPCR试剂应避免反复冻融试剂应避免反复冻融试剂配制时不能佩戴有粉手套试剂配制时不能佩戴有粉手套PCR mixPCR mix与与TaqTaq酶充分混匀酶充分混匀u加模板加模板时应避免吸到沉淀避免吸到沉淀 漂浮的杂质常粘附于管壁，中间吸样较安全漂浮的杂质常粘附于管壁，中间吸样较安全u切勿在切勿在PCR管上做管上做标记，但，但应注意注意样本本顺序序u上机前上机前应离心去除气泡离心去除气泡u标准品加准品加样时应尽量避免加尽量避免加样误差，影响差，影响标准曲准曲线仪器检测通道选择仪器检测通道选择HPV13荧光荧光 报告荧光报告荧光 淬灭荧光淬灭荧光13种高危型 FAM NoneHPV12+2 报告荧光报告荧光 淬灭荧光淬灭荧光12种高危型FAM NoneHPV16HEX/JOENoneHPV18ROX/Red 610None-globin Cy5 NoneSTD系列系列产品品vCT/NG/UUCT/NG/UU联合检测试剂盒联合检测试剂盒v淋球菌核酸检测试剂盒淋球菌核酸检测试剂盒v沙眼衣原体核酸检测试剂盒沙眼衣原体核酸检测试剂盒v解脲脲原体核酸检测试剂盒解脲脲原体核酸检测试剂盒样本本类型型&采集方法采集方法v宫颈脱落细胞宫颈脱落细胞 用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处宫颈脱落细胞。v泌尿生殖道标本泌尿生殖道标本 用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检（采集标本前2小时禁小便）。样本保存本保存样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱箱44存放，并在一周时间内检测。应避免反复冻融。存放，并在一周时间内检测。应避免反复冻融。一周后检测的标本应保存在一周后检测的标本应保存在一周后检测的标本应保存在一周后检测的标本应保存在-20-20-20-20 。棉拭子样本应在真空管中保存，要操作前再加生理棉拭子样本应在真空管中保存，要操作前再加生理盐水盐水/ /细胞保存液进行洗脱。细胞保存液进行洗脱。DNA提取提取 取取800ul800ul样本离心得沉淀样本离心得沉淀 加入细胞裂解液加入细胞裂解液50ul50ul，煮沸，煮沸10min10min 12000 12000离心离心10min10min即可上机即可上机若肉眼未见沉淀，可增加取样量，再次离心收集沉淀；若沉淀杂质较多，可用细胞保存液洗涤1-2次；血液多样本，用蒸馏水洗涤1-2次；粘液多样本，取样时尽量去除粘液。应注意防止爆盖：金属浴可压重物（冰盒、冰袋等）水浴应采用螺旋管盖的离心管确保离心管质量合格优点优点：简单、快捷、方便。：简单、快捷、方便。缺点缺点：HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。抑制剂。v针对泌尿生殖道样本（棉拭子样本）（棉拭子样本），先用细胞保存液/生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致PCR试剂配制试剂配制 PCR MIX（l） Taq 酶（酶（l） DNA 模板（模板（l）1人份量 17.5 0.5 2/人份10人份量 1755 2/人份v按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装对照设置对照设置u定性定性试验 每次试验都必须设置阴阳性对照每次试验都必须设置阴阳性对照u定量定量试验 个别医院要求定量结果，需增加标准品个别医院要求定量结果，需增加标准品（10105 5、10106 6、10107 7、10108 8 copiescopies） 标准品一般可以反复冻融标准品一般可以反复冻融3-43-4次，超过次，超过5 5次，则不建议使用次，则不建议使用 标准品置于标准品置于-20-20中保存中保存操作注意事项操作注意事项uPCR试剂保存配制保存配制PCRPCR试剂应放于试剂应放于-20-20避光保存避光保存PCRPCR试剂应避免反复冻融试剂应避免反复冻融试剂配制时不能佩戴有粉手套试剂配制时不能佩戴有粉手套PCR mixPCR mix与与TaqTaq酶充分混匀酶充分混匀u加模板加模板时应避免吸到沉淀避免吸到沉淀 漂浮的杂质常粘附于管壁，中间吸样较安全漂浮的杂质常粘附于管壁，中间吸样较安全u切勿在切勿在PCR管上做管上做标记，但，但应注意注意样本本顺序序u上机前上机前应离心去除气泡离心去除气泡u标准品加准品加样时应尽量避免加尽量避免加样误差，影响差，影响标准曲准曲线仪器检测通道选择仪器检测通道选择单一微生物单一微生物 报告荧光报告荧光 淬灭荧光淬灭荧光NG/CT/UUFAMNone-globinHEX/JOE NoneCT/NG/UU联合 报告荧光报告荧光 淬灭荧光淬灭荧光CTFAM NoneNGHEX/JOENoneUUROX/Red 610None-globin Cy5 None乙肝病毒定量乙肝病毒定量产品品v对临床血清标本中的乙型对临床血清标本中的乙型肝炎病毒（肝炎病毒（HBVHBV）核酸）核酸DNADNA的的定量检测定量检测样本本类型型&采集方法采集方法v血清样本血清样本 用无菌注射针头抽取患者静脉血2 ml，于无菌收集管中，室温放置不超过4 h， 1500 rpm离心5 min，吸取血清转入1.5 ml离心管中备用。v血浆样本血浆样本 用无菌注射针头抽取患者静脉血2 ml，于含有EDTA作为抗凝剂的无菌收集管中，室温放置不应超过4 h，1500 rpm离心5 min，吸取血浆转入1.5 ml离心管中备用样本保存本保存样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱箱2-82-8存放，并在存放，并在72h72h内检测内检测-20-20-20-20保存不超过保存不超过3 3个月个月-70-70下长期保存下长期保存应避免反复冻融应避免反复冻融DNA提取提取 1）取200ul样本于1.5ml离心管中（血清/血浆/阴阳质控品/阳性标准品)；2）加入20ul蛋白酶K；3）加入200ul溶液L，混匀，56温浴10-15min；4）加入200ul无水乙醇，充分混匀；5）将全部液体转移至带收集管的硅胶柱中；6）10000rpm离心1min，弃废液；7）加入500ul溶液W1（确保已加入乙醇）（确保已加入乙醇）；8）10000rpm离心1min，弃废液；9）加入500ul溶液W2（确保已加入乙醇）（确保已加入乙醇）；10）10000rpm离心1min，弃废液；11）加入500ul溶液W2（确保已加入乙醇）（确保已加入乙醇）；12）10000rpm离心1min，弃废液；13）空管离心，12000rpm离心3min，丢弃收集管；14）将硅胶柱装入新1.5ml离心管中，开盖1-2min；15）往硅胶柱中心加入60-200ul的TE，静置3-5min；16）12000rpm离心2min，弃柱得DNA。提取前，应将HBV内标加入到裂解液中溶液L：HBV内标=200 l：0.5l温浴后，加样前应点动离心乙醇可提取放于冰箱，低温可提高DNA的沉降效率样本管编号与硅胶柱编号应一一对应TE可提前预热，但温度不宜过高，可提高DNA的洗脱效率硅胶柱编号与新离心管编号应一一对应PCR试剂配制试剂配制PCR MIX（l） Taq 酶（酶（l）UNG酶（酶（l） DNA 模板（模板（l）1人份量 19.2 0.60.220/人份10人份量1926220/人份v按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装对照设置对照设置u定量定量试验每次试验均需设置一个强阳性对照、一个临界阳性对照、一个阴性对每次试验均需设置一个强阳性对照、一个临界阳性对照、一个阴性对照照加样顺序为待测样本加样顺序为待测样本DNA、阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照、阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照、对照上清液、阳性工作标准品对照上清液、阳性工作标准品1-4（5106 IU/ml、5105 IU/ml、5104 IU/ml、5103 IU/ml）操作注意事项操作注意事项uPCR试剂保存配制保存配制PCRPCR试剂应放于试剂应放于-20-20避光保存避光保存PCRPCR试剂应避免反复冻融试剂应避免反复冻融试剂配制时不能佩戴有粉手套试剂配制时不能佩戴有粉手套PCR mixPCR mix与与TaqTaq酶酶/UNG/UNG酶充分混匀酶充分混匀u加模板加模板时应注意加注意加样量的准确性，减少定量的操作量的准确性，减少定量的操作误差差u切勿在切勿在PCR管上做管上做标记，但，但应注意注意样本本顺序序u上机前上机前应离心去除气泡离心去除气泡仪器检测通道选择仪器检测通道选择HPV定量 报告荧光报告荧光 淬灭荧光淬灭荧光HBVFAM None内标HEX/JOENone整体操作流程整体操作流程DNADNA提取提取PCRPCR试剂配制、加样试剂配制、加样样本采集样本采集结果分析结果分析上机扩增上机扩增结果分析结果分析u设置基置基线（以（以ABI仪器器为例）例）若有若有CtCt16的强阳性样本，将此样本定为强阳性，并将此样本从数据的强阳性样本，将此样本定为强阳性，并将此样本从数据库中剔除，然后以库中剔除，然后以3-15个循环的平均荧光信号作为基线再分析个循环的平均荧光信号作为基线再分析Ct值；值；若该样本需进行定量，则将其稀释后再重新扩增若该样本需进行定量，则将其稀释后再重新扩增 ；若无若无CtCt1616的强阳性样本，应选的强阳性样本，应选3-15个循环的平均荧光信号作为基线个循环的平均荧光信号作为基线再分析再分析Ct值。值。u设置置阈值线 基线和阴性对照的上方，同时保证在指数增长期内基线和阴性对照的上方，同时保证在指数增长期内u整体整体扩增曲增曲线观察察整体扩增曲线平滑整体扩增曲线平滑 阴性对照、阳性对照结果正常阴性对照、阳性对照结果正常弱阳性样本拐点明显弱阳性样本拐点明显每个样本的内质控曲线观察：若无内质控曲线，应观察是否有其他每个样本的内质控曲线观察：若无内质控曲线，应观察是否有其他型别阳性曲线；均无曲线，则该样本扩增无效，需复查型别阳性曲线；均无曲线，则该样本扩增无效，需复查若有标准曲线，两两标准曲线之间等距离，高低值标准品的若有标准曲线，两两标准曲线之间等距离，高低值标准品的CtCt值是值是否在正常范围内，观察回归系数、斜率、截距等参数否在正常范围内，观察回归系数、斜率、截距等参数结果分析结果分析三、荧光荧光PCR异异常结果分析常结果分析u扩增曲线扩增曲线u标准曲线标准曲线u原始数据原始数据常见故障排除常见故障排除异常扩增曲线异常扩增曲线u基线设置是否正确基线设置是否正确 基线校正基线校正 基线开始值基线开始值 基线终止值基线终止值u阈值设置是否正确阈值设置是否正确 设置在指数增长期设置在指数增长期 自动或手动设置自动或手动设置扩增曲线出现交叉扩增曲线出现交叉u多引物、多探针反应多引物、多探针反应体系中，每个类型的扩体系中，每个类型的扩增效率不一致到导致增效率不一致到导致u样本本身的原因导致样本本身的原因导致荧光曲线的差异荧光曲线的差异 扩增曲线平台期低扩增曲线平台期低u样本浓度问题样本浓度问题u引物二聚体或浓度问题引物二聚体或浓度问题扩增曲线指数增长期异常扩增曲线指数增长期异常u无指数增长期？无指数增长期？u指数增长期较短？指数增长期较短？扩增曲线不光滑扩增曲线不光滑u样本信号值太弱，点样本信号值太弱，点与点之间的差距被放大与点之间的差距被放大u扩增时间开始较晚，扩增时间开始较晚，定量不准确定量不准确 扩增曲线呈直线上升扩增曲线呈直线上升u部分探针降解，降解部分探针降解，降解的探针也会形成信号，的探针也会形成信号，但信号值比较低但信号值比较低u加入的样本加入的样本DNA含有含有较多的杂质较多的杂质 扩增曲线呈直线上升扩增曲线呈直线上升u基线的终点大于基线的终点大于Ct值，值，其中包含部分指数增长其中包含部分指数增长期信号，导致标准偏差期信号，导致标准偏差偏大，阈值过高偏大，阈值过高u反应管内留有气泡，反应管内留有气泡，由于温度升高后导致气由于温度升高后导致气泡破裂，使荧光值突然泡破裂，使荧光值突然降低降低阴性对照产生较高荧光阴性对照产生较高荧光uPCR mix被污染被污染uPCR管有杂质管有杂质u反应过程探针降解反应过程探针降解标准曲线线性关系不佳标准曲线线性关系不佳u稀释精度差稀释精度差u加样精度差加样精度差u反应体系需优化反应体系需优化u标准品降解标准品降解精密度差精密度差u加样误差：操作、移液器、加样误差：操作、移液器、反应液未混匀反应液未混匀u体系配制方法体系配制方法u低拷贝数的样本低拷贝数的样本u仪器未校准仪器未校准u实验室管理应严格按照实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范基因扩增实验室的管理规范u实验室管理规范实验室管理规范创新专业创新专业追求卓越追求卓越