兽用疫苗生产与质量控制张渊魁福州大北农生物技术有限公司主要内容1.兽用生物制品简介2.疫苗的定义和分类3.疫苗生产工艺简介4.疫苗生产质量控制5.疫苗研究发展趋势一、兽用生物制品简介1.兽用生物制品概念2.兽用生物制品分类1、兽用生物制品概念概念：系用天然或人工改造的微生物、寄生虫、生物毒素或生物组织及代谢产物等为材料，采用生物学、分子生物学或生物化学等相应技术制成的一类生物活性制品，用于预防、治疗和诊断畜禽等动物疾病兽用生物制品学科：是一门涉及多种学科领域的应用科学（微生物学、免疫学、生物化学、实验动物学、细胞学、分子生物学、制冷学、生物工程学、管理学等）2、兽用生物制品分类按生物制品性质分类疫苗（vaccine）：接种动物后能产生自动免疫和预防疾病的一类生物制剂称为疫苗。类毒素（toxoid）：又称脱毒毒素，是指细菌生长繁殖过程中产生的外毒素，经化学药品（如甲醛）处理后成为无毒性但保留免疫原性的生物制剂，接种动物后也能产生自动免疫，产生抗毒素血清。诊断制品（diagnostic preparation）：利用微生物、寄生虫及其代谢产物，或动物血清、组织等，根据免疫学和分子生物学原理制备，用于疫病诊断、免疫监测和病原鉴定的一类生物制剂。抗病血清（antiserun）：或高免血清，为含有高效价特异性抗体的血清，能用于治疗或紧急预防相应病原体所致的疾病。微生态制剂（probiotics）：又称活菌制剂，是用非病原微生物如乳酸杆菌、双歧杆菌等活菌制剂，口服治疗畜禽肠道正常菌群失调引起的下痢。副免疫制品（paraimmunity preparation）： 这类物质能通过刺激机体，提高特异性和非特异性免疫，从而使动物机体对其他抗原物质的特异性免疫力更强更持久，如脂多糖、多糖、缓释微球、细胞因子，免疫刺激复合物等。普通制品：指用一般方法制备的、未经浓缩和纯化处理，或仅按毒（效）价标准稀释的制品。如现有国内的大部分传统疫苗均为普通制品。精制生物制品：将普通制品（原制品）经浓缩和纯化处理，去除无效成分，毒（效）价高于普通制品效力更好，如精制破伤风毒素和精制结核菌素等。液状制品：湿性制品。一些灭活疫苗如兔病毒性出血症灭活疫苗 ，诊断制品如血清、抗原等为液状制品。多数既不耐高温和阳光，又不宜低温冻结和反复冻融，否则其效价会受到影响，只能在低温冷暗处保存，保存时间较短。干燥制品：液状制品加入适当稳定剂或冻干保护剂经冷冻真空干燥处理，将96%以上水分除去后剩留疏松海绵状的物质，为干燥制品，生物制品经干燥后能较长时间保护活性和抗原效价。佐剂制品：为了增强疫苗制剂诱导动物机体的免疫应答反应，提高免疫效果，在疫苗制备的过程中加入适量的佐剂，如氢氧化铝胶、油佐剂等，这类制品称为佐剂制品。二、疫苗的定义和分类1.疫苗定义2.疫苗分类1、疫苗定义由特定细菌、病毒、立克次体、衣原体等微生物及寄生虫制成的，接种动物后能产生自动免疫和预防疾病的一类生物制剂均称为疫苗，制剂的主要成分为微生物或寄生虫。2、分类按微生物分类1.细菌类疫苗2.病毒类疫苗3.寄生虫类疫苗按疫苗抗原的性质和制备工艺分类活疫苗（live vaccine）p弱毒活疫苗p基因缺失疫苗p基因工程活载体疫苗p病毒抗体复合疫苗：特异性高免血清与适当比例的相应病毒组成，其特点是可以延缓病毒释放，提高疫苗的安全性和免疫效果。活疫苗特点p可在体内繁殖p系统免疫反应和局部免疫反应p免疫力持久，产量高，成本低p有毒力增强和反祖危险p抗原干扰现象p保存条件苛刻死疫苗（killed vaccine）p灭活疫苗：由完整的病毒或细菌经灭活剂灭活后制成，即要使病原体充分死亡，丧失感染性或毒性，又要保留其免疫原性。 p亚单位疫苗：是指将病原体经物理或化学方法处理，除去无效物质，提取其有效抗原部分制备的一类疫苗，经提取、纯化，通过化学合成，制成不同的亚单位疫苗。p基因工程重组亚单位疫苗：利用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性的基因 导入原核或真核细胞，使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原肽链，提取肽链加入佐剂制成。该类疫苗安全性好，副反应小（有害的反应原少），稳定性好，便于保存和运输，但研发、生产成本高，免疫原性较差，需多次免疫才能得到有效保护。死疫苗特点p不能在体内繁殖p有利于制备多价或多联疫苗p比较安全，不发生全身性副反应，无毒力反祖现象p受外界影响小，有利于保存运输p免疫剂量大，需多次免疫，成本高p只能诱导机体产生体液免疫p通常需要用佐剂或携带系统来增强其免疫效果基因疫苗（genetic vaccine）： 包括DNA疫苗和RNA疫苗，是将编码某种抗原蛋白的基因置于真核表达元件的控制下，构成重组表达质粒DNA或RNA，将其直接注入动物体内，通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生抗原蛋白的免疫应答。单价疫苗（univalent vaccine）：利用同一种微生物（菌）毒株或同一种微生物中的单个血清型（菌）毒株的增殖培养物制备的疫苗。多价疫苗（polyvalent vaccine）：利用同一种微生物（菌）毒株或同一种微生物中的多个血清型（菌）毒株的增殖培养物制备的疫苗多联疫苗（mixed vaccine）：利用不同的微生物增殖培养物，按免疫学原理和方法组合而成的疫苗。接种动物后能获得相应疾病的免疫保护，一针多防，可减少劳动力和动物应激。按疫苗病原菌（毒）株来源分类同源疫苗：采用同种、同型或同源微生物制备，应用于同类动物免疫接种的疫苗。异源疫苗：采用不同种微生物的（菌）毒株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对疫苗中未含有的病原体产生抵抗力，如犬在接种麻疹疫苗后，能产生对犬瘟热的抵抗力。或采用同一种中一种型微生物的（菌）毒株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对异型病原体的抵抗力。三、疫苗生产工艺介绍1.疫苗生产基本条件2.疫苗生产工艺流程3.生产中影响疫苗质量的关键环节4.疫苗抗原制造技术介绍5.疫苗检验6.疫苗保存1、疫苗生产基本条件产品批准文号菌（毒）种疫苗制造及检验规程GMP厂房、设施和仪器设备产品批准文号农业部颁发批准文号GMP证书(具备该疫苗生产线)产品复核检验(具备生产该疫苗的能力)标签、说明书样稿审查(符合规程规定)省级文号？菌 （毒）种菌（毒）种是疫苗生产必备的原材料，国家对菌（毒）的保管和使用有严格的规定和限制（生物安全问题）。生产疫苗的菌（毒）种来源：中国兽医药品监察所或新兽药转让单位。菌（毒）种保管和使用：基础种毒由中国兽医药品监察所或其委托的保管单位进行生产、鉴定和保管，生产用种子批由企业生产、鉴定和保管。菌 （毒）种分类 菌（毒）种分强毒和弱毒强毒：通常指从得病动物体内分离到的致病毒株，只能用于制造灭活疫苗和检验用弱毒：通常是采用人工的方法用强毒致弱而成，一般于制造活疫苗菌 （毒）种质量标准生物学特性明显、历史清楚：形态、培养特性、生化特性及血清免疫学特性等明显，易于鉴别；人工感染动物引起稳定一致的临床症状和病理变化特征；原始细菌或病毒株的来源地区、动物品种流行资料清楚；分离鉴定资料完整；传代、保藏和生物学特性检查方法明确。遗传学上相对纯一与稳定：菌毒种在传代增殖过程中某些遗传形状会发生改变和分离，如形态特征、毒力、反应原性、免疫原性等方面，因此要求制造生物制品的菌（毒）种的这种改变和分离越小越好，应经常进行挑选，纯化和克隆。反应原性和免疫原性优良：反应原性高，即使微量量的抗原物质进入机体内既能产生强烈的免疫反应，血清学上会出现很高的特意性；优良的免疫原性物质能使免疫动物产生完善的免疫应答，从而获得坚强的免疫力毒力应在规定的范围以内：用于制造弱毒疫苗的菌毒种，毒力应尽量弱一些；用于制造抗血清、灭活疫苗和疫苗效力检测的菌（毒）种毒力应强，且抗原性要尽量高菌（毒）种的筛选程序和内容细胞EID50ELD50TCID50稳定性实验冻干、冷冻或冷藏保存反应原性免疫原性血清学实验攻毒保护实验病毒分离纯粹性试验致病性试验抗原性试验原动物LD50筛选出毒力强、抗原性好、生长稳定、纯净的毒株，用于制备疫苗、诊断液和治疗用抗体或疫苗效力检验用实验动物鸡胚细胞反应原性纯粹性试验抗原性试验原动物致病性试验病毒分离弱毒菌（毒）种的选育弱毒菌（毒）种的选育自然弱毒株的分离人工诱变致弱同源动物（如NDVLaSota株）异源动物（HVTFC126株）化学途径物理途径生物途径亚硝基胍醋酸坨洗衣粉高温紫外线适应非易感动物或细胞杂交减毒疫苗制造及检验规程任何一种疫苗都有其制造及检验规程，它是国家法定标准。疫苗的生产必须严格按规程规定的方法进行生产和检验，若要改变方法，则要提供研究材料证明是可行的，并报农业部评审批准，形成新规程才能进行生产。规程来源p中华人民共和国兽用生物制品规程（常规疫苗）p转让单位（新兽药）厂房、设施和仪器设备GMP证书是疫苗生产的准入证， 疫苗生产必需拥有与生产工艺相符合的生产线 GMP 生产车间设计要求p功能区：抗原制备区、成品生产区、洗涤区、办公区。各区域和功能间以洁净走廊相连，严格按人流物流分开原则进行设计。p洁净度：按各功能间洁净度、压力、压差要求设计施工。有10万级区、万级区和局部百级区。p六大系统：供电、供水、供汽、污水处理、净化、监控。厂房、设施和仪器设备检验设施p质检室p检验动物舍（应配备有符合各类实验动物级别饲养设施）仓储设施p原辅材料库p半成品库p成品库厂房、设施和仪器设备灭菌设备：高压蒸气灭菌柜、干热箱、锅炉等；净化设备：净化机组、无菌室、超净工作台等；微生物培养设施设备：温室、孵化器、细胞培养转瓶机、各种罐体、生化培养箱等；乳化设备：各种罐体、胶体摸、高压匀浆机等；冻干设备：冻干机；灌装设备：洗烘连动线、自动灌装加塞联动机；包装设备：扎盖机、帖标机；冷藏冷冻设施设备：冷库、冷柜、液氮罐等；污水废弃物处理设施设备：灭菌柜、消毒罐、污水处理站；检验仪器设施设备：各种显微镜、水分测定仪、二氧化碳培养箱、生物安全柜、动物房等。福州大北农公司总体布局图主主厂房厂房大动物房大动物房小动物房小动物房质检楼质检楼锅炉房锅炉房污水污水处理站处理站脾林苗脾林苗仓储仓储办公区办公区大门大门生活区生活区疫苗生产工艺流程 菌（毒）种 培养物（培养基、动 物、禽胚或细胞等） 收获抗原（培养液、含毒组织、胚液或细胞液等） 配苗 分装 冻干成活疫苗或灭活后制成灭 活疫苗。细菌疫苗的制造流程蛋白胨、肉浸液等原料培养基培养基配制、灭菌菌种生产用种子生产用种子培养菌液菌液菌苗原液配苗分装冻干冻干、扎盖帖签活疫苗原料佐剂佐剂灭活菌液配苗乳化乳化分装、扎盖、帖签灭活疫苗灭活灭活检验配制、灭菌保护剂保护剂原料配制、灭菌病毒性细胞疫苗的制造工艺流程健康动物（或胚胎）组织原料细胞悬液细胞悬液生长细胞病毒液病毒液配苗分装冻干冻干、扎盖帖签活疫苗基础种毒生产用种毒生产用种毒原料保护剂保护剂配制灭菌细胞培养液传代细胞传代细胞灭活病毒液配苗（混匀、乳化乳化）分扎盖帖签装灭活疫苗检验原料佐剂佐剂配制灭菌灭活灭活检验配制培养收获病毒性组织疫苗的制造工艺流程感染动物或胚胎分装、扎盖、贴签健康动物或SPF鸡胚等健康动物或健康动物或SPFSPF鸡胚等鸡胚等动物或SPF鸡胚等基础种毒生产用种毒生产用种毒收获感染组织或胚液收获感染组织或胚液纯化配制成含毒悬液配苗分装冻干冻干活疫苗保护剂保护剂原料配制检验灭活病毒液配苗、乳化乳化灭活疫苗原料佐剂配制灭活灭活检验影响疫苗质量的关键环节活疫苗生产用菌（毒）种的制备是否优良制苗用抗原制备（微生物增殖）是否高效冻干保护剂的选择和冻干曲线的制定是否合理灭活疫苗生产用菌（毒）种的制备是否优良制苗用抗原制备（微生物增殖）是否高效抗原灭活是否彻底乳化工艺是否先进疫苗抗原制造技术介绍细菌类疫苗抗原增殖技术（培养基增殖）细菌培养是指细菌在动物体外的人工培养基上以及人工控制的环境中（通常用培养罐进行培养）生长繁殖的过程。细菌性疫苗都是利用培养基制造的，首先通过分离培养，获得单个菌落，制备细菌种子，然后逐级培养进行规模化生产。细菌类疫苗抗原增殖技术（关键控制点）培养基质量：培养细菌类疫苗抗原的培养基一般是人工制备的一种液体培养基，它含有培养相应细菌所需营养成分，包括水、氮源、碳源、无机源和生长因子等它的好坏直接影响到产菌量和检验结果。生产用菌种菌落挑选符合细菌培养特性活菌含量符合要求纯净无污染代次按规定控制工艺的稳定性培养条件工艺技术（各种参数如种子接种量、培养时间、收获时间等）传统病毒类疫苗抗原增殖技术动物增殖禽胚增殖细胞增殖5、疫苗检验活疫苗物理性状（冻干苗） 无菌检验（纯粹检验）鉴别检验：特异性血清中和检验。外源病毒检验（病毒类疫苗）：中和法检验。活菌计数（细菌类疫苗）：平板计数。病毒含量测定（病毒类疫苗） ：EID50、ELD50或TCID50。安全检验：动物或鸡胚（剂量几倍至几十倍）效力检验：攻毒保护或微生物含量测定。水份测定（冻干苗）：4%以内。真空度测定（冻干苗）：白色、粉色或紫色辉光。灭活疫苗灭活检验：半成品检测：EID50、ELD50或TCID50 。物理性状：外观、剂型、稳定性、粘度检验。无菌检验：培养基检测安全检验：动物检验效力检验：攻毒保护或测抗体。灭活剂含量测定：化学分析6、疫苗保存疫苗对温度极为敏感，保存不当会使效价严重受损（尤其是活疫苗）或剂型破坏，并导致疫苗失效，因此应严格在规定的条件下保存。7、猪瘟活疫苗产品介绍种类：猪瘟活疫苗根据抗原制备途径不同又分为：猪瘟活疫苗（成兔脾淋源）猪瘟活疫苗（乳兔源）猪瘟活疫苗（细胞源）猪瘟活疫苗（牛体源）疫苗研究和发展历史背景3.6猪瘟活疫苗产品介绍生产和使用对比疫苗类型使用种毒抗原制备方法质量标准生产成本临床使用猪瘟活疫苗（成兔脾淋源）猪瘟兔化弱毒接种成兔，采集兔体脾淋组织150个RID高非特异免疫强抗原含量高过敏率低猪瘟活疫苗（乳兔源）猪瘟兔化弱毒接种乳兔，采集乳兔肌肉组织150个RID较高无非特异免疫抗原含量较低过敏率高猪瘟活疫苗（细胞源）猪瘟兔化弱毒接种牛睾丸细胞，收货细胞培养液750个RID（新标准7500 RID）低无非特异免疫，抗原含量高，过敏率较高猪瘟活疫苗（牛体源）猪瘟兔化弱毒接种犊牛，采集犊牛脾淋组织150个RID较底非特异免疫强抗原含量高过敏率低猪瘟活疫苗质量控制要素菌毒种纯净（细菌和外源性病毒污染）含毒量高于国家标准代次控制在5代以内原材料的选择组织苗p家兔的选择（兔种、年龄、体重、健康状况等）p乳兔的选择（日龄、体重、健康状况等）细胞苗p细胞的选择（无污染外原病毒等）猪瘟活疫苗质量控制要素生产环境控制 组织苗p动物饲养条件控制p接毒后动物反应观察与判断p生产线功能间洁净级别要求 细胞苗p细胞检测（BVDV等）p健康细胞和接毒后细胞的观察与判断p生产线功能间洁净级别要求半成品检测成品检测四、疫苗生产质量控制1.质量控制意义2.质量控制要求3.质量控制保证措施（兽药GMP管理）4.疫苗质量评价1、质量控制意义国家强制要求 禽流感事件，人血白蛋白事件企业自身要求 品牌、效益、责任 生物制品特殊性表现在在生产和使用过程中人和动物的安全性（污染、混毒、人畜共患）对环境的安全性群体性危害2、质量控制要求安全性：毒副作用、残留、环境、人类有效性：有效成分达到要求，疗效确切均一性：批间、最小单元间、贮存运输后等稳定性：贮存期稳定，有较长的有效期方便性：给药的方式、途径经济性：在保证质量的前提下，改进生产工艺，提高效力，降低成本3、保证措施兽药GMP管理 GMP是英文Good Manufacturing Practice for Drugs的缩写，直译为“优良产品的生产实践”。我国的兽药GMP是药品生产质量管理规范的简称。 兽药GMP是在兽药生产过程中，用科学、规范化的条件和方法来保证生产优良兽药的整套科学体系。它实施的目标就是对兽药生产的全过程进行质量控制，以保证生产的兽药质量是合格优良的。 3、保证措施兽药GMP背景 GMP是从药品生产实践中取得经验教训的总结。人类社会经历了12次药物灾难，特别是20世纪出现的药物灾难“反应停”事件后，公众要求制定严格监督法律；最早的GMP是由美国坦普尔大学6名教授编写制定；1963年美国颁布第一部GMP，美国FDA经过实施；1975年WHO正式公布GMP，开始向成员国推荐，并确定为WHO的法规之一，迄今为止有100多个国家实施了GMP；我国医用药品从1982年开始颁布GMP，农业部于己于1989年颁布并决定实施GMP，规定至2005年12月31日未取得GMP合格证的企业，不得进行药品生产。3、保证措施控制要求生产、管理人员生产、管理人员厂房、设施、设备厂房、设施、设备原料、包装材料原料、包装材料生产方法生产方法检验、监控检验、监控售后服务售后服务经检验合格的经检验合格的经过验证的经过验证的可靠的可靠的完善的完善的经验证合适的经验证合适的训练有素的训练有素的GMPGMP基本控制要求基本控制要求影响质量的因素影响质量的因素完善的完善的管理文件管理文件3、保证措施控制要求在GMP管理要求中，3条主线贯穿全过程生产处处防污染：原材料或产品被微生物或外来物搀杂、玷污、混杂、失真、遗漏、任意等造成产品的质量问题，生产过程对环境和人员的安全性：事物件件有验证：能证明任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统能导致预期结果，有文件证明的行动。凡是须问个为什么？怎么样？好不好？行不行？-通过验证-放心使用工作一律守制度：有一项工作或活动就必须有一项制度；有制度就必须执行；有执行就必须有综合（分析、检查）；有综合就有提高（改进、修订）3、保证措施管理软件软件：是指企业对管理体系中采用的全部要素、要求和规定编制成各种制度、标准和程序形成文件系统，在实施中及时正确地记录执行情况且保存完整的执行记录。从组织架构、工作标准到记录（凭证）等都进行了详细的制定，它是质量控制的重要保证。3、保证措施过程控制方法过程控制方法：监督加检查（检验）人员（培训、技能等）原辅材料（供应商评估、小样实验、检验 ）设备仪器定期验证和校验生产过程监督和检查（半成品检验）产品检验（企业内控标准）批记录核查、批签发售后服务（运输、保存、使用注意事项、客户访问、退回产品的处理、不良反应的处理等）3、保证措施过程控制目标控制管理目标把影响产品质量的人为差错，减少到最低程度防止一切对产品的污染、交叉污染和产品质量下降的情况发生建立完善的质量保证体系，确保GMP的有效实施 产品质量优劣取决于企业的质量观是否保证GMP的有效实施 四、疫苗质量评价生产过程评价检验结果评价安全性效力稳定性临床使用效果评价（国家标准与企业内控标准差异）自家苗？五、疫苗研究发展方向传统疫苗改进精制化（减少副反应）；规模化（改进工艺、提高产能、降低成本）；耐热化（有利于保存和运输）；多联多价化（减少动物应激）；高效化（改进疫苗质量，提高内控标准，增强疫苗免疫效果，如种毒的改造、佐剂的运用等）。新型疫苗研发：以分子生物学技术为基础，研究新型疫苗是新世纪疫苗研究的主导方向。新病（包括变异）疫苗研发：企业与科研单位联合开发已成为趋势，一些企业成立的研发部门也在从事基础研究和临床应用研究，为生产出高质量的疫苗奠定了基础 谢谢！