mmu-miR-125a-5pmmu-miR-125a-5p 研究策略研究策略micrmicrONON mmu mmu-miR-125a-5p-miR-125a-5pmimicmimicmicrmicrOFFOFF mmu mmu-miR-125a-5p-miR-125a-5pinhibitor,inhibitor,StandardStandard2ng2ng报价报价StandardStandard报价报价350 RMB5ng600 RMB300 RMB5ng500 RMB转染转染 mmu-miR-125a-5p mimic(24mmu-miR-125a-5p mimic(24 孔板为例孔板为例) )1联系锐博公司合成 mmu-miR-125a-5p mimic 和 mmu-miR-125a-5pinhibitor;2合成的 2ng mmu-miR-125a-5p mimic 用 1000ul RNase-free water 配制成20uM的储存液,分装成5ul每管放-30或-80冻箱冻存(mimic的工作浓度为50nM);3转染前一天，胰酶消化细胞并计数 1X105c-kit-，细胞铺板，使其在转染日密度为 90%。细胞铺板在细胞铺板在 0.5ml0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中;4对于每孔细胞，使用 50l 无血清无血清培养基（如如 OPTI-MEMOPTI-MEM培养基培养基）稀释 1.25ul mmu-miR-125a-5p mimic 存储液;5 5对于每孔细胞，使用 50l OPTI-MEM无血清无血清培养基稀释 1l1lLIPOFECTAMINE 2000 试剂。Lipofectamine 2000 稀释后室温 5 5 分钟（在 30 分钟内同稀释的 RNA 混合。 室温时间过长会降低活性。 ）注意：注意： 即使 Lipofectamine2000 使用 OPTI-MEM稀释，细胞也可以使用 D-MEM 培养。如果如果D-MEMD-MEM做做为为Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000的稀释液，必须在的稀释液，必须在5 5分钟内同稀释的分钟内同稀释的DNADNA混合混合6混合稀释的 RNA（第 4 步）和稀释的 Lipofectamine 2000（第 5 步）。在室温保温保温 2020 分钟分钟。 注意：注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持 6 小时稳定7直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀,加入 500ul 培养基,混匀。注意：注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为 0.5ml 无血清培养基8在 37，5的 CO2 中保温 24-4824-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在 4-54-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性9在细胞中加入复合物 24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周.实验优化实验优化: :miRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究的目的而异,锐博推荐的 miRNA mimic初始浓度为 50nM,miRNA inhibitor的浓度为 100nM,可以根据实验具体的情况优化转染的浓度,优化的范围为 10-200nM10-200nM注:miRNA inhibitor 往往需要用到较大的量才能观察到较好的抑制效果,相当于miRNA mimic的几倍用量,这可能与miRNA inhibitor抑制的作用机制及作用效率有关.因此,当使用推荐的转染浓度没有获得预期的效果时 ,可适当选择更高的浓度.