交叉配血知识讲座交叉配血知识讲座7/24/20241标本的采集及要求标本的采集及要求一一血型血型二二不规则抗体的筛选不规则抗体的筛选 三三交叉配血交叉配血四四7/24/20242一一标标本本的的采采集集及及要要求求v1.标本要新鲜: 前三个月内病人输过血或已经妊娠,则配血试验使用的标本不得在这次输血的48小时前抽取,避免因回忆反应产生的抗体漏检。新近的输血或妊娠可以引起意外抗体的迅速出现,如果对病人的输血史或人身史不明,使用的标本必须是输血前48小时内抽取的。血量约为5ml 。v2.病人在使用右旋糖酐、pvp等治疗前抽取病人血液标本备用,以防止红细胞缗钱状凝集对试验结果的干扰。7/24/20243标标本本的的采采集集及及要要求求v3.在24小时内输了12单位血后,可以输注未经交叉配血的ABO、RH同型的血液,因为原始交叉配血用的血清已不能代表患者血清的情况。v4.标本必须有正确的标签,要防止血样的稀释和溶血的产生,溶血的标本一般不能使用,因为血清中的游离血红蛋白可以掩盖在输血前实验中抗体反映引起的溶血。标本标签上的内容与血液申请单上的内容要一致。7/24/20244标标本本的的采采集集及及要要求求v5.血清或血浆均可用于输血前检查,但使用血浆标本时,应注意排除纤维蛋白原的干扰,因为血浆有时有少许纤维蛋白凝块,容易导致凝集结果的判断。v6.输血后所有的标本均应妥善保存于2-8冰箱中,至少一周。7/24/20245二、血二、血 型型v1.红细胞悬液的配制 用于血型鉴定、配血等的红细胞至少要用大量生理盐水洗一次,其目的是通过洗涤可以去除红细胞表面的物质,如少量的血浆蛋白、已溶解红细胞的基质,他们有竞争抗体的作用,还有抗凝剂,他们有抗补体的作用。7/24/202462. 红红细胞悬细胞悬液的常液的常用浓度用浓度2%的红细胞悬液一般用于抗体效价的测定的红细胞悬液一般用于抗体效价的测定5%的红细胞悬液一般用于血型鉴定、配的红细胞悬液一般用于血型鉴定、配血试验、及抗球蛋白试验等大多数血型血血试验、及抗球蛋白试验等大多数血型血清学试验清学试验10%的红细胞悬液一般用于测定抗体的亲的红细胞悬液一般用于测定抗体的亲和力试验和力试验7/24/202473.离心力的标准离心力的标准 v不同规格离心机，力矩不同，统一离心转速，但没有统一离心力。离心转速换算公式：RCF = 1.118 RCF = 1.118 10 10-5 -5 (rpm) (rpm) 2 2 R R (cm) (cm)v将试管成30-45角拿在手上，细胞扣朝上，手腕轻轻用力，用液体去冲细胞扣，如果为阴性，则细胞成细沙状沿试管壁流下，如果为阳性，细胞成块状脱落细胞壁或成齿状沿试管壁留下。切不可用力使劲摇试管，那样凝集颗粒会被摇散，弱凝集则会误判为阴性。 4.离心后结果观离心后结果观察注意事项察注意事项 7/24/20248v5.加样时先加血清再加红细胞，以避免漏加；抗体和抗原的比例一般为2：1。v6.必须要做正反定型实验才能确定血型。v7.正定型试验如果有条件可加做抗AB,可用来检测弱A和弱B ,反定型一定要加做O细胞,可用来发现不规则抗体。7/24/20249v8.盐水试验多采用立即离心法,正确的操作是红细胞悬液加到血清后立即离心并观察结果。反应时间过长而延误立即离心的时间对ABO血型系统的抗体检出影响较大。 如果在室温放置2分钟后离心,可能使3+-4+的凝集减弱为0+-1+,并伴有溶血现象。 如果在室温放置5分钟后离心,原有的凝集可能消失,并有溶血。7/24/202410 有的标本在延迟离心后,本来应有的凝集会变为既不凝集也不溶血,因而难以发现ABO血型的不配合。这多数发生在O型人的血清抗体与A型、B型或AB型红细胞反应的试验中,发生率为2%-3%。发生上述的原因是反应强的抗A、抗B和抗原强度强的A、B抗原作用,补体C1在有Ca2+存在的条件下,固定到红细胞膜上,妨碍了红细胞的凝集,进一步可能引起溶血。解决的方法：vA:血清与红细胞混合后立即离心。vB:用血浆或灭活的血清做试验vC:用EDTA盐水配制红细胞悬液,vD:稀释血清7/24/2024119. 9. 正反定型不一致的原因正反定型不一致的原因一般正反定型结果不一致有技术原因也有受检红细胞或血清本身的的问题。（1）技术和管理错误-ABO定型中产生异常结果主要原因v标本和试剂搞错，造成假阳性或假阴性的结果。v器材不洁产生假阳性结果。v试剂污染或不足，产生假阳性或假阴性的结果。v离心过度或不足，产生假阳性或假阴性的结果。v阳性反应产生溶血现象未能识别，导致假阴性结果。v漏加试剂，产生假阴性结果。v结果记录或判断错误，产生假阳性或假阴性结果。7/24/202412正反正反定型定型不一不一致的致的原因原因（2）标准血清效价太低、亲和力不强。如抗A血清效价不高，可将A亚型误定为O型，AB型误定为B型。（3）红细胞悬液过浓或过淡，抗原抗体比例不适当，使反应不明显，误判为阴性反应。（4）血清异常 华通胶或血清蛋白异常引起串钱状形成，影响反定性结果。（5）红细胞致敏 在含高蛋白介质的试剂中可发生凝集，产生假阳性结果。7/24/202413（6）近期曾异型输血，使病人血液标本成为不同型别的红细胞混合物，定型时显示“混合 外观凝集”现象。（7）疾病因素导致抗原减弱 某些白血病病人ABO血型抗原可受到抑制，检出困难。（8）红细胞多凝集现象 红细胞因遗传或获得性的表面异常，发生多凝集现象。（9）获得性类B 由于革兰氏阴性杆菌的作用，红细胞可获得“类B”活性。7/24/202414正反正反定型定型不一不一致的致的原因原因（10）近期内进行大量的血浆置换治疗，影响抗体效价，造成反定型困难。（11）异常血浆蛋白 病人血浆中异常的白蛋白、球蛋白比例异常和高浓度的纤维蛋白原等能导致缗钱状形成，造成假凝集现象。（12）不规则抗体的产生 受检者血浆中，含有ABO血型抗体以外的不规则抗体，如自身抗I，与试剂A、B细胞上的相应抗原起反应。7/24/202415（13）低丙种球蛋白血症 可能会因免疫球蛋白水平全面下降使血清定型时不见凝集或仅见弱凝集反应。（14）药物等因素 药物、右旋糖酐等静脉注射某些造影剂可引起红细胞聚集而类似凝集。（15）年龄因素 如新生儿、老年人等。7/24/202416正反定型不一致的处理方法正反定型不一致的处理方法v如发现ABO正反定性不一致，首先要重做试验一次。严格执行操作规程，使用质量合格的试剂以及细心观察结果，可解决明显的问题，对一些疑难问题需进一步检查。可初步采取以下措施： （1）另从受检者采取1份新鲜血液标本，这样 可以纠正因污染或搞错标本造成的不符合。 （2）将红细胞洗涤数次，配成5%盐水细胞悬 液，用抗A、抗B、抗A+B做实验，可以得到其他有用的信息。有条件的可加做抗H试验。7/24/202417（3）对受检者作直接抗人球蛋白试验，看红细胞有没有被致敏（4）如疑为A抗原或B抗原减弱，可将受检红细胞与抗A或抗B血清作吸收放散试验（5 5）如试验结果红细胞成缗钱状排列，加等渗盐水1滴混匀，往往可使缗钱现象消失。（6 6）做反定型试验时需要加做）做反定型试验时需要加做O O细胞细胞7/24/202418常用的记录符号及所示的凝集强度常用的记录符号及所示的凝集强度v4+:一个大的凝集块,背景透明,无游离细胞v3+:数个大凝集块,背景透明,无游离细胞v2+:许多小凝集块,肉眼可见,大小均匀,背景基本透明,有游离细胞v1+:很小的凝集块,肉眼可见,背景不透明,游离细胞较多,需要用显微镜观察vW+:微小凝集块,肉眼很难看清,背景混浊,需要用显微镜观察vO:无凝集,无溶血,全部是游离细胞,要用显微镜观察vPH:部分溶血vH:完全溶血vWF:混合外观7/24/202419v疑难血型病例v1.白血病血型变异v2.血浆蛋白紊乱v3. 类Bv4.多/全凝集v5.冷凝集v6.ABO亚型7/24/202420三、不规则抗体的筛选三、不规则抗体的筛选v 1.所谓不规则抗体是指抗A、抗B以外的血型抗体，其多为抗体。主要是经输血或妊娠等免疫刺激产生。进行不规则抗体的筛选的目的是发现有临床意义的不规则抗体，以确保安全用血，有效用血，有条件或时间允许的情况下最好献血者血清也作不规则抗体的筛选，如有发现不规则抗体，鉴定此抗体，找出能与其相配合的血液，不可随便用于输血。因为多为抗体，在盐水介质中不能凝集而只能致敏相应抗原的红细胞,必须通过特殊介质(酶、抗人球蛋白、等)才能使致敏红细胞出现凝集反应，这些方法的选择可按抗体的血清学行为和试验的具体条件来确定。临床上通常所称的“同型血”实际上是指血型系统和血型系统相同,其它红细胞血型系统未必相同。如果交叉配血不仔细,或者只用盐水介质配血,则有可能检查不出血型系统之外的不规则抗体,而此抗体与相应抗原发生免疫反应,可导致溶血性输血反应的发生。 7/24/2024212.筛选细胞通常是由2-3个单人份的O型红细胞组成一套筛选细胞试剂，包括以下常见的抗原：Rh系统 、MNSs系统、P系统、Lewis系统、Duffy系统等。3.抗体筛选试验不一定能检出所有有临床意义的不规则抗体。一些抗低频率抗原的抗体则可能漏检。7/24/202422不规则抗体筛选的操作步骤不规则抗体筛选的操作步骤v病人病人/被检血清被检血清 + 抗体筛选细胞抗体筛选细胞 盐水介质盐水介质v 非盐水介质（聚凝胺、抗球蛋白、酶）非盐水介质（聚凝胺、抗球蛋白、酶） v1、取试管四支，标明、取试管四支，标明、和自身对照并向各管加病人血清（血浆）和自身对照并向各管加病人血清（血浆）100ul，加，加5%筛选细胞（筛选细胞（、）各）各50ul于于、 管中和管中和5%自身细自身细胞于自身对照管中。胞于自身对照管中。v2、各加、各加LIM0.6ML，混合均匀后，静置，混合均匀后，静置15秒秒,再各加再各加Polybrene 溶液溶液100ul(约约2滴滴)，并混合均匀。，并混合均匀。v3 、以、以1300G离心，离心离心，离心15秒，然后把上清液倒掉，不要沥干，让管底残留秒，然后把上清液倒掉，不要沥干，让管底残留约约0.1ML液体。液体。v4、轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重作。、轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重作。v5、最后加入、最后加入Resuspending 100ul(约约2滴滴) ，轻轻转动试管混合并同时观察，轻轻转动试管混合并同时观察结果。如果凝集散开，表示是由结果。如果凝集散开，表示是由Polybrene引起的非特异性聚集，抗体筛检结引起的非特异性聚集，抗体筛检结果为阴性；如凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，抗体筛果为阴性；如凝集不散开，则为红细胞抗原抗体结合的特异性反应，抗体筛检结果为阳性，应进一步作抗体鉴定。检结果为阳性，应进一步作抗体鉴定。7/24/202423 抗筛阴性，交叉配血相容抗筛阴性，交叉配血相容 抗筛阴性，盐水直接离心交叉配血不相容原因有：抗筛阴性，盐水直接离心交叉配血不相容原因有：献血者红细胞是献血者红细胞是ABOABO血型不相容血型不相容存在在室温反应的同种异体抗体存在在室温反应的同种异体抗体献血者的红细胞是多凝集红细胞献血者的红细胞是多凝集红细胞4. 4. 抗体筛选和交叉配血试验结果分析抗体筛选和交叉配血试验结果分析7/24/202424 抗筛阴性，酶试验、抗球蛋白交叉配血试验等不相抗筛阴性，酶试验、抗球蛋白交叉配血试验等不相容容 献血者红细胞献血者红细胞DATDAT试验为阳性试验为阳性受血者血清抗体活性很弱，则抗筛试验成阴性受血者血清抗体活性很弱，则抗筛试验成阴性抗体与低频率抗原反应抗体与低频率抗原反应 抗筛阳性，交叉配血相容抗筛阳性，交叉配血相容自身抗自身抗-H-H抗抗- -LebhLebh抗筛阳性，但献血者红细胞可能正好不含与相应的抗筛阳性，但献血者红细胞可能正好不含与相应的抗原，因此配血可以相合。抗原，因此配血可以相合。7/24/202425 抗筛阳性，交叉配血不相容抗筛阳性，交叉配血不相容同种异体抗体存在，自身对照成阴性同种异体抗体存在，自身对照成阴性同种异体抗体存在，自身对照成阳性同种异体抗体存在，自身对照成阳性冷反应自身抗体能引起难以确定的阳性冷反应自身抗体能引起难以确定的阳性温反应自身抗体能引起难以确定的阳性温反应自身抗体能引起难以确定的阳性“钱串状钱串状”红细胞形成引起非真实的阳性结果红细胞形成引起非真实的阳性结果7/24/202426v输血前试验“三保险”:血型、抗筛、交叉配血v 相合%v 随机 64v ABO 99.4v Rh 99.8v 抗筛 99.94v 交叉配血 99.95v 自身输血 1007/24/202427四、交叉配血四、交叉配血v交叉配血试验也称配合性试验，实际上是检查不配合性，使病人，献血者血液之间没有可测到的不相配合的抗原，抗体成分，试验应在37下进行。试验方法除作盐水介质外，还有抗球蛋白试验法、酶法、聚凝胺法或其改良法。在配血的任何步骤中均不产生溶血或凝集献血者的血液才能给予病人输注。7/24/2024281.盐水法盐水介质中红细胞上的抗原决定族与相应抗体分子上的抗原结合位点结合，交叉连接形成肉眼可见的凝集块。盐水介质凝集试验用于IgM抗体的检出、鉴定、盐水配血试验以及用盐水抗体鉴定的血型抗原，如ABO、MN、P等血型系统的抗原。在盐水介质中，凝集是IgM抗体的行为。当抗A、抗B的浓度足够大时，在盐水介质里也能与相应的红细胞发生凝集反应2.低离子聚凝胺试验Poly是一种带高价阳离子的多聚物，溶解后能产生很多正电荷，可中和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间距离减少，能引起正常红细胞可逆行的非特异性凝集。如果是抗体致敏的红细胞被聚凝胺，则凝集不可逆。 7/24/2024293.酶处理细胞的凝集试验酶处理细胞的凝集试验v红细胞表面有丰富的唾液酸，带有负电菏，是红细胞互相排斥的原因。蛋白水解酶能消化破坏这种唾液酸，减少红细胞表面的负电菏。Zata电势减少，红细胞的间距缩短，抗体分子能与有相应抗原的红细胞产生凝集。酶法能显著增强Rh和Kidd系统的抗原抗体反应，但蛋白酶能破坏M、N、S、s、Fya和Fyb抗原，酶法不适应这些抗原的检测。常用的酶有菠萝酶、木瓜酶、无花果酶等。酶的浓度为0.5%。7/24/202430酶处理细胞的凝集试验方法酶处理细胞的凝集试验方法一期一期酶法酶法 也称直接法，菠萝酶和木瓜酶适用于一期法。操作时在已标记好的试管中加入100ul的血清和50ul的红细胞悬液，再加50ul的酶溶液，37孵育15分钟，1000转/分离心1分钟，轻摇后观察结果二期二期酶法酶法 也称间接法，木瓜酶和无花果酶适用于二期法。二期分两步，第一步是酶处理红细胞：在1份洗涤的压积红细胞中加两份木瓜酶溶液，37孵育30分钟，用大量的Ph7。4的PBS洗涤3次，用生理盐水配成5%的悬液备用。第二步是在已标记好的试管中加受检血清100ul ,再加50ul酶处理过的红细胞悬液，37孵育15-30分钟观察结果，凝集和溶血皆属于阳性反应。7/24/2024314.抗人球蛋白抗人球蛋白vAGT试验又称Coombs试验,是检查IgG抗体的最有效的方法.抗球蛋白血清除了可测定红细胞上的IgG抗体外,还可以测定IgM和IgA,也可以测补体组分(C3、C4).AGT包括直接抗人球试验和间接抗人球试验.v直接抗人球试验试验是检查体内致敏红细胞的一种方法,用于检查红细胞是否已被不完全抗体所致敏,如新生儿溶血病、溶血性输血反应 、自身免疫性溶血性贫血.v间接抗人球蛋白试验是一种检测血清中不完全抗体的方法,常用于血型鉴定、抗体的检出和鉴定、输血前交叉配血试验等.7/24/2024325.微柱凝胶法微柱凝胶法v微柱凝胶法v利用分子筛原理7/24/202433主管主管次管次管自身对照自身对照7/24/202434几种交叉配血方法的比较几种交叉配血方法的比较方法方法优点优点缺点缺点盐水法操作方便,费用低廉只能检出不相配合完全抗体,不能检出不相配合的不完全抗体 酶法增强Rh 、Kidd系统破坏MNSs、Fy(a) 、Fy(b)抗原,易失活,寿命短,反应时间长 聚凝胺法方便、应用最广Kell系统部分抗体如抗K 、抗 kp(a) 、抗kp(b)检测不出,需要抗球蛋白试验.且肝素对其有影响,易引起假阴性.抗球蛋白法检测不完全抗体最灵敏的方法 操作复杂、不利于急诊检查和血库的大批量工作微柱凝胶法国际安全输血检查的推荐方法，灵敏度高、重复性好、特异性好、检测结果可较长时间保存费用高7/24/202435疑难配血病例疑难配血病例v1.患冷凝集素综合征,有自身冷凝集抗体, “O”,病人血清自身抗体4+.采用抗人球蛋白法配血可消除此现象,输“O”洗涤红细胞.v2.输血前:“A”,输A型红细胞4u,无明显反应,仅见少许Hb尿,很快消失,但Hb从入院时12g降至4g,该院误定血型而输血前没做交叉配血而造成本次事故.v -A -B AC BCv 正定 4+ 3+ 反定 - - v因与抗A反应管的细胞似有二群细胞,后做唾液酸血型物质测定,确定其血型为“B”型,因之前输入大量的“A”型血.本次不适合输“B”型血,建议输注“O”洗涤红细胞.7/24/202436v3. “O”,Rh(+),贫血查因,消化道出血,消化道肿瘤,直接抗人球蛋白试验2+,检出自身抗体,经吸收处理后标本可与“O”红细胞配血.v4.重度贫血患者,直接抗人球蛋白试验1+,筛选试验盐水法、抗人球蛋白试验均为阴性,交叉配血时可采用抗人球胆白法,可输注O型洗涤红细胞.7/24/2024377/24/202438