第五章第五章 微生物的生长繁殖与微生物的生长繁殖与生存因子生存因子1第一节第一节 微生物的生长繁殖微生物的生长繁殖微生物生长繁殖的概念微生物生长繁殖的概念研究微生物生长的方法研究微生物生长的方法细菌生长曲线在污废水处理中的应用细菌生长曲线在污废水处理中的应用微生物生长量的测定微生物生长量的测定2基本概念基本概念生长：微生物在适宜的环境条件下，不断吸收生长：微生物在适宜的环境条件下，不断吸收生长：微生物在适宜的环境条件下，不断吸收生长：微生物在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢活动。当同化作用大于异化作用时，微生物的活动。当同化作用大于异化作用时，微生物的活动。当同化作用大于异化作用时，微生物的活动。当同化作用大于异化作用时，微生物的细胞的迅速增大。（细胞质量的增加和个体体细胞的迅速增大。（细胞质量的增加和个体体细胞的迅速增大。（细胞质量的增加和个体体细胞的迅速增大。（细胞质量的增加和个体体积的加大，即细胞组分与结构在积的加大，即细胞组分与结构在积的加大，即细胞组分与结构在积的加大，即细胞组分与结构在量方面的增加量方面的增加量方面的增加量方面的增加）繁殖：当单细胞个体生长到一定程度时，由一繁殖：当单细胞个体生长到一定程度时，由一繁殖：当单细胞个体生长到一定程度时，由一繁殖：当单细胞个体生长到一定程度时，由一个亲代细胞分裂为两个大小、形状与亲代细胞个亲代细胞分裂为两个大小、形状与亲代细胞个亲代细胞分裂为两个大小、形状与亲代细胞个亲代细胞分裂为两个大小、形状与亲代细胞相似的子代细胞，使得个体数目增加（相似的子代细胞，使得个体数目增加（相似的子代细胞，使得个体数目增加（相似的子代细胞，使得个体数目增加（质的变质的变质的变质的变化化化化）。）。）。）。3基本概念基本概念 发育：从生长到繁殖由量变到质变的过程。发育：从生长到繁殖由量变到质变的过程。 世代时间：细菌两次细胞分裂之间的时间。世代时间：细菌两次细胞分裂之间的时间。 在一定的培养条件下，微生物的世代时间是一在一定的培养条件下，微生物的世代时间是一在一定的培养条件下，微生物的世代时间是一在一定的培养条件下，微生物的世代时间是一定的，当环境条件发生改变，其世代时间也会定的，当环境条件发生改变，其世代时间也会定的，当环境条件发生改变，其世代时间也会定的，当环境条件发生改变，其世代时间也会改变改变改变改变 原核微生物的繁殖速度一般比真核微生物快，原核微生物的繁殖速度一般比真核微生物快，原核微生物的繁殖速度一般比真核微生物快，原核微生物的繁殖速度一般比真核微生物快，专性厌氧菌的世代时间多数比好氧菌的长专性厌氧菌的世代时间多数比好氧菌的长专性厌氧菌的世代时间多数比好氧菌的长专性厌氧菌的世代时间多数比好氧菌的长4研究微生物生长的方法研究微生物生长的方法微生物的生长可分为个体微生物生长和微生物的生长可分为个体微生物生长和群体微生物生长。多数通过培养研究其群体微生物生长。多数通过培养研究其群体生长群体生长。vv生长生长细菌群体数量的增长细菌群体数量的增长，不是个体，不是个体，不是个体，不是个体体体体体积积的增的增的增的增长长。 vv提提提提问问：为为什么什么什么什么这这里不考察里不考察里不考察里不考察细细菌个体的生菌个体的生菌个体的生菌个体的生长长呢？呢？呢？呢？ v个体太小，难观察计量个体太小，难观察计量 v群体细菌对环境产生影响群体细菌对环境产生影响5一一山山不不容容二二虎虎vv提问：提问：弱势生物的群居优势是什么？弱势生物的群居优势是什么？ v生存状况提高，攻防具佳生存状况提高，攻防具佳 v（攻）（攻）群居的细菌获得营养的能力大大高于游离群居的细菌获得营养的能力大大高于游离的细菌，的细菌， （防）（防）群居的细菌不易被天敌伤害，群居的细菌不易被天敌伤害，还能释放类似外激素的调节因子，使群体主动适还能释放类似外激素的调节因子，使群体主动适应环境的变化，可有性生殖；应环境的变化，可有性生殖； v团结就是力量团结就是力量 6 外界因素引起的外界因素引起的外界因素引起的外界因素引起的细菌数量的增加、停滞、衰细菌数量的增加、停滞、衰细菌数量的增加、停滞、衰细菌数量的增加、停滞、衰减等变化。减等变化。减等变化。减等变化。 提提提提问问：如何研究呢？如何研究呢？如何研究呢？如何研究呢？ 测测菌数量菌数量菌数量菌数量变变化与外因的关系化与外因的关系化与外因的关系化与外因的关系提问：细菌群的提问：细菌群的提问：细菌群的提问：细菌群的“ “生、老、病、死生、老、病、死生、老、病、死生、老、病、死” ”表现为何呢表现为何呢表现为何呢表现为何呢？7（“坐吃山空型坐吃山空型”）应用用：生理特性研究、生物生理特性研究、生物生理特性研究、生物生理特性研究、生物发发酵和生物治酵和生物治酵和生物治酵和生物治污污8细菌生长曲线细菌生长曲线稳定期定期衰衰亡亡期期细菌菌数数目目的的对数数值0时间t t细细菌的数量很大，都是菌的数量很大，都是菌的数量很大，都是菌的数量很大，都是1010的的的的n n次方次方次方次方，取，取，取，取对对数作数作数作数作图时图时方便，方便，方便，方便，010010代表代表代表代表1 110101010总总菌数菌数菌数菌数活菌数活菌数活菌数活菌数 停停 滞滞 期期对数数期期9停滞期停滞期细菌菌数数目目的的对对数数值值停停滞滞期期0时间t提提提提问问：为为什么会出什么会出什么会出什么会出现现停滞停滞停滞停滞期呢？期呢？期呢？期呢？ 代代代代谢谢活活活活跃跃，个体体个体体个体体个体体积积、重量增高、重量增高、重量增高、重量增高 不立即不立即不立即不立即进进行行行行细细胞分裂、增殖，胞分裂、增殖，胞分裂、增殖，胞分裂、增殖，数量不变甚至减少数量不变甚至减少适适应环境（境（合成相合成相应的的酶），营养养储备（用于复制合用于复制合成成）岗岗前培前培前培前培训训10故称故称对数期对数期。细菌数目菌数目X X增增长率倍率率倍率的的对数对数与与时间成正比。成正比。对数期对数期（青年）（青年）11细菌菌数数目目的的对对数数值值对数数期期0时间t 如大如大肠杆菌在杆菌在20时其代其代时是是35条件下的条件下的2倍；倍； 伤寒杆菌在含寒杆菌在含0.125的蛋的蛋白白胨培养基中的代培养基中的代时为800min，而在含而在含1.0时仅为40min。 繁殖速度最快繁殖速度最快繁殖速度最快繁殖速度最快 种种种种类遗传类遗传 个体健康情况个体健康情况个体健康情况个体健康情况( (营营养、养、养、养、环环境条件境条件境条件境条件) )12对数期数期细菌代菌代时G计算算1221222223(2(22)2)2)2)2422522nt0tX=X0*2nX/X0=2nX X0XX0224 X (X X (X022n) ) ( (n=1n=1、2 2、3 3) n n繁殖代数繁殖代数繁殖代数繁殖代数 代代时13处于对数生长期的细胞，由于代谢旺盛，处于对数生长期的细胞，由于代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，个体形态、化学生长迅速，代时稳定，个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，因此，在组成和生理特性等均较一致，因此，在微生物发酵生产中，常用对数期的菌体微生物发酵生产中，常用对数期的菌体作种子，它可以缩短停滞期，从而缩短作种子，它可以缩短停滞期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。对数生长期的细胞也是研究微生物生长对数生长期的细胞也是研究微生物生长代谢与遗传调控等生物学基本特性的极代谢与遗传调控等生物学基本特性的极好材料。好材料。 14静止期静止期 死亡原因死亡原因死亡原因死亡原因 营营养短缺、代养短缺、代养短缺、代养短缺、代谢谢毒物增多毒物增多毒物增多毒物增多 （相当于重量（相当于重量（相当于重量（相当于重量变变化曲化曲化曲化曲线线中的增中的增中的增中的增长长率下降率下降率下降率下降阶阶段段段段）细菌菌数数目目的的对对数数值值0时间t 稳定期定期15人类群体有类似规律吗人类群体有类似规律吗？衰亡期（老年）（老年）16稳稳定期定期定期定期细细胞胞胞胞基基基基本耗尽了各种本耗尽了各种本耗尽了各种本耗尽了各种辅酶或其他细辅酶或其他细辅酶或其他细辅酶或其他细胞成分胞成分胞成分胞成分受受受受损细损细胞胞胞胞养养养养伤伤修复修复修复修复富集培养基富集培养基富集培养基富集培养基细细菌需要菌需要菌需要菌需要合成合成合成合成“ “自力更生自力更生自力更生自力更生” ”酶酶菌种本身的菌种本身的菌种本身的菌种本身的遗传遗传特性（如特性（如特性（如特性（如转转基因高效菌基因高效菌基因高效菌基因高效菌）和接种）和接种）和接种）和接种数量数量数量数量也会影响也会影响也会影响也会影响停滞停滞停滞停滞期的期的期的期的长长短。短。短。短。17采用采用处于于高效菌群高效菌群对数期数期的菌种的菌种、增大接种量增大接种量、尽量尽量保持保持接种前后所接种前后所处的培养介的培养介质和条件一致和条件一致等方法来等方法来缩短或消除短或消除迟缓期期提提问：我我我我们们可以通可以通可以通可以通过过哪些手段哪些手段哪些手段哪些手段缩缩短短短短停滞停滞停滞停滞期呢？期呢？期呢？期呢？18提提提提问问：哪个哪个哪个哪个时时期期期期（迟缓期、对数期、稳定期、衰（迟缓期、对数期、稳定期、衰（迟缓期、对数期、稳定期、衰（迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期）亡期）亡期）亡期）代代代代时时最具有种属代表性？最具有种属代表性？最具有种属代表性？最具有种属代表性？为为什么？什么？什么？什么？ 对数期对数期对数期对数期代代代代时时 对对数期数期数期数期细细菌菌菌菌代代代代谢谢活力活力活力活力强强、生生生生长长速率快速率快速率快速率快、群体、群体、群体、群体细细胞胞胞胞化学化学化学化学组组分分分分、形形形形态态和生理特性和生理特性和生理特性和生理特性等比等比等比等比较较一致。一致。一致。一致。 教学教学教学教学实验实验和和和和发发酵工酵工酵工酵工业业用用用用对对数期数期数期数期细细胞做胞做胞做胞做实验实验材料。材料。材料。材料。 细细菌菌代代时时通通常常指指最最适适条条件件下下的的对对数数期代时期代时19微生物的生长曲线，反映一种微生物在微生物的生长曲线，反映一种微生物在一定的生活环境中一定的生活环境中 ( ( 如试管、摇瓶、发如试管、摇瓶、发酵罐酵罐 ) ) 生长繁殖和死亡的规律。它既可生长繁殖和死亡的规律。它既可作为营养物和环境因素对生长繁殖影响作为营养物和环境因素对生长繁殖影响的理论研究指标，也可用为调控微生物的理论研究指标，也可用为调控微生物生长代谢的依据，以指导微生物生产实生长代谢的依据，以指导微生物生产实践。践。 20通过对微生物生长曲线的分析，可见：通过对微生物生长曲线的分析，可见： 微生物在对数生长期生长速率最快。微生物在对数生长期生长速率最快。 营养物的消耗，代谢产物的积累，以及因此引起营养物的消耗，代谢产物的积累，以及因此引起的培养条件的变化，是限制培养液中微生物继续快速的培养条件的变化，是限制培养液中微生物继续快速增殖的主要原因。增殖的主要原因。 用生活力旺盛的对数生长期细胞接种，可以缩短用生活力旺盛的对数生长期细胞接种，可以缩短延迟期，加速进入对数生长期。延迟期，加速进入对数生长期。 补充营养物，调节因生长而改变了环境补充营养物，调节因生长而改变了环境pH pH 、氧化氧化还原电位，排除培养环境中的有害代谢产物，可延长还原电位，排除培养环境中的有害代谢产物，可延长对数生长期，提高培养液菌体浓度与有用代谢产物的对数生长期，提高培养液菌体浓度与有用代谢产物的产量。产量。 对数生长期以菌体生长为主，稳定生长期以代谢对数生长期以菌体生长为主，稳定生长期以代谢产物合成与积累为主。根据发酵目的的不同，确定在产物合成与积累为主。根据发酵目的的不同，确定在微生物发酵的不同时期进行收获。微生物生长曲线可微生物发酵的不同时期进行收获。微生物生长曲线可以用于指导微生物发酵工程中的工艺条件优化以获得以用于指导微生物发酵工程中的工艺条件优化以获得最大的经济效益。最大的经济效益。21连续培养培养一方面一方面连续进料，另一方面又料，另一方面又连续出料。出料。 原理：原理：进料料=补足足营养养(“污染物染物”) 出料出料=稀稀释菌菌浓度、毒物度、毒物浓度度 它又分它又分为两种：两种：恒恒浊连续培养培养、恒化恒化连续培养培养。22新新鲜培养基培养基光光电池池光源光源流速控制流速控制阀出出出出水水水水 很少很少很少很少应应用用用用 反反反反馈馈控控控控制制制制23新新鲜培养基培养基流速控制流速控制阀出出出出水水水水n n应应用：用：用：用：环环境工程、生境工程、生境工程、生境工程、生物工程、物工程、物工程、物工程、实验实验室研究室研究室研究室研究（细细菌生理特性研究、菌生理特性研究、菌生理特性研究、菌生理特性研究、细细菌的快速菌的快速菌的快速菌的快速筛选筛选等等等等）。）。）。）。 流速恒定流速恒定流速恒定流速恒定进进料料料料营营养物养物养物养物总总量量量量2425细菌生长曲线在污水处理中的应用细菌生长曲线在污水处理中的应用不同废污水生物活性污泥处理法中，其不同废污水生物活性污泥处理法中，其活性污泥中微生物的生长状态不同，或活性污泥中微生物的生长状态不同，或处于静止期，或处于对数期，或处于衰处于静止期，或处于对数期，或处于衰亡期等亡期等在废水生物处理设计时，按废水的水质在废水生物处理设计时，按废水的水质情况（主要是有机物浓度），可利用不情况（主要是有机物浓度），可利用不同生长阶段的微生物处理废水同生长阶段的微生物处理废水26连续生物处理中的细菌状态表连续生物处理中的细菌状态表细菌的生菌的生长阶段段应用用举例例特点特点迟缓期期无无连续化化稳定操作中没有定操作中没有这一一阶段段对数生数生长期期高高负荷活性荷活性污泥法泥法 ( (大部分区域大部分区域) )稳定期定期生物膜法生物膜法常常规活性活性污泥法泥法 ( (大部分区域大部分区域) )生生长繁殖快，代繁殖快，代谢活力活力强，能大量，能大量去除去除废水中有机物。水中有机物。（缺点是缺点是细菌菌表面的表面的粘液粘液层和和荚膜尚未形成膜尚未形成，运，运动很活很活跃，不易自行凝聚成菌胶，不易自行凝聚成菌胶团，沉淀性能差沉淀性能差，致使出水水，致使出水水质有有机物机物浓度相度相对较高高）衰老期衰老期低低浓度度污水延水延时曝气法曝气法污泥的泥的厌氧消化氧消化营养物养物浓度度过低，低，难以以满足其他足其他阶段段细菌的生菌的生长需要需要虽然比然比对数生数生长期的差，但仍有相期的差，但仍有相当的代当的代谢活力，活力，细菌体内菌体内积累了大累了大量量贮存物，如异染粒、聚存物，如异染粒、聚羟基基丁酸等，体表的粘液丁酸等，体表的粘液层和和荚膜膜强化化了了细菌的生物吸附能力，菌的生物吸附能力，自我絮自我絮凝、聚合能力凝、聚合能力强，在二沉池中泥水，在二沉池中泥水分离效果好，分离效果好，出水水出水水质好好。 细细菌与降解菌与降解菌与降解菌与降解BODBOD重量比重量比重量比重量比1:0.41:0.4以下以下以下以下1:0.40.81:0.40.8BOD.dBOD.d- -27进水水对数期数期稳定期定期衰老期衰老期平平流流式式活活性性污泥泥法法占占优势28微生物生长量的测定方法微生物生长量的测定方法（一）（一）直接计数法直接计数法（测微生物总数）（测微生物总数）借助显微镜观察测定借助显微镜观察测定优点：优点：优点：优点：快速快速快速快速提问提问提问提问: :有哪些缺点有哪些缺点有哪些缺点有哪些缺点? ?缺缺缺缺点点点点：不不不不能能能能区区区区分分分分细细细细菌菌菌菌的的的的死活死活死活死活分四种分四种 ：290.050.052mmmm225250.1ml0.1ml菌液菌液m30提提问：数了数了125个小格中有个小格中有90个个细菌，菌，样品中的品中的细菌菌浓度是度是多少？多少？(90个个125) * 400 / 0.1ml =2880个个/ml 适用范适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物细细菌菌个个体体若若太太小小、过过多多，由由于于每每一一小小格格中中细细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。数数数数细菌（或其他微生物或菌（或其他微生物或细胞）数目，胞）数目，（一般数一般数125个小格个小格），），折算折算样品品细菌菌浓度；度；311 1视野菌液视野菌液(ml)(ml)(0.01(0.01mlml 1 1cmcm2 2)*)*视视野面野面野面野面积积(cm(cm2 2) )32提提提提问问：如果如果如果如果平均每个视野中平均每个视野中细菌数量细菌数量/ /红血球红血球的数量的数量比例为比例为5.55.5：1 1，则细菌数量，则细菌数量= =？5.5400万个万个/m l =2.2107个个/ /mL样品样品红血血球球数数已已知知(男男性性400500400500万万万万个个个个mlml，女女性性350450350450万万万万个个个个mlml)，平均平均400400万个万个/ml/ml细细菌菌菌菌红红血血血血球球球球33提提提提问问：如何定量二者关系呢？如何定量二者关系呢？如何定量二者关系呢？如何定量二者关系呢？ 细细菌菌菌菌不不不不完完完完全全全全透透透透光光光光，一一一一定定定定范范范范围围内内内内菌菌菌菌溶溶溶溶液液液液的的的的混混混混浊浊浊浊度度度度与与与与菌数量成菌数量成菌数量成菌数量成正比正比34浊度仪浊度仪或或721721分光光分光光度仪度仪3536无菌水无菌水1.1.1.1. 稀释平板计数法稀释平板计数法稀释平板计数法稀释平板计数法固体培养法固体培养法固体培养法固体培养法第一步：菌样巧妙稀释第一步：菌样巧妙稀释第一步：菌样巧妙稀释第一步：菌样巧妙稀释得到不同得到不同稀稀释度度 （10-x）菌液菌液菌菌菌菌样样被被被被无菌水无菌水无菌水无菌水不同稀不同稀不同稀不同稀释释倍率倍率倍率倍率后后后后平板平板平板平板培养培养培养培养图图37 10-2 10-3 10-4 10-5 各各各各取取取取1ml1ml，均均均均匀匀匀匀涂涂涂涂布布布布于于于于冷冷冷冷固固固固体体体体培培培培养养养养基基基基平平平平板板板板上上上上或或或或与与与与温温温温热热液液液液态态固固固固体体体体培培培培养养养养基基基基混合混合混合混合冷却。冷却。冷却。冷却。第三步：培养第三步：培养第三步：培养第三步：培养稀稀稀稀释释度度度度过过低，低，低，低，菌落密菌落密菌落密菌落密集无法集无法集无法集无法计计数数数数可以可以可以可以计计数，数，数，数，但数量但数量但数量但数量过过多，多，多，多，费时费时费费力力力力 数量合数量合数量合数量合适，适，适，适，统统计计计计算，算，算，算，作作作作为结为结果果果果数量太少，数量太少，数量太少，数量太少，误误差因素差因素差因素差因素太大，太大，太大，太大，不不不不做做做做计计数数数数 第二步：接种平板第二步：接种平板第二步：接种平板第二步：接种平板每一个每一个每一个每一个细细菌会生成一个菌会生成一个菌会生成一个菌会生成一个菌落菌落菌落菌落38n n第四步第四步第四步第四步： 计数计数计数计数n细菌数量菌数量=？ n细菌数量菌数量=数出的菌落数数出的菌落数/稀稀释度度n例如：例如：10-5稀稀释度度时菌落数菌落数为125个个 n细菌数量菌数量=125/10-5=1.25107个个/mL n 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法平板计数法是采用最广的一种活菌计数法 n如如国国标标法法水水中中细细菌菌菌菌落落总总数数（CFUColony Forming Unit）的的测测定定 。 n注注意意：作作空空白白及及取取平平行行样样（2 23 3组组）均均值值减减小小误差误差平均39n对这类菌可以利用它们生长时产生的对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征硫化亚铁黑色特征进进行行深层隔氧液体培养深层隔氧液体培养，按，按MPNMPN法进行计数。法进行计数。4041n n方法：方法：含菌水含菌水含菌水含菌水样样在在在在105105110110下下下下进进行干燥恒重行干燥恒重行干燥恒重行干燥恒重（本本本本质测质测水中水中水中水中悬悬浮物重量浮物重量浮物重量浮物重量MLSSMLSS或或或或MLVSSMLVSS）。2. 细胞含胞含N量法量法3. DNA含量法含量法 4. 其它生理生化指其它生理生化指标法法Mixed Liquor Suspended Solids Mixed Liquor Suspended Solids Mixed Liquor Volatile Suspended Solids Mixed Liquor Volatile Suspended Solids 42n n无机物化学性无机物化学性无机物化学性无机物化学性质稳质稳定，高温下不会分解定，高温下不会分解定，高温下不会分解定，高温下不会分解 n n提提提提问问：什什什什么么么么情情情情况况况况下下下下可可可可以以以以直直直直接接接接用用用用悬悬浮浮浮浮物物物物的的的的重重重重量量量量表表表表示示示示细细菌的重量？菌的重量？菌的重量？菌的重量？n n悬浮物中绝大多数是细菌。n n干重法干重法43离心沉淀离心沉淀 滤膜膜过滤计算算105110下下进行干燥行干燥恒重恒重恒重恒重称重称重或或或或MLSSMLSS悬浮物悬浮物悬浮物悬浮物44550下灼下灼烧2h称重称重105110下下进行干燥恒重行干燥恒重称重称重MLSS4546视视要求、水要求、水要求、水要求、水样样菌量、菌量、菌量、菌量、测试测试条件等等灵活条件等等灵活条件等等灵活条件等等灵活选选取取取取47