分光光度法和分光光度法和 722分光光度计的使用分光光度计的使用The Depart. of Biochemistry Shenyang Medical Institute 1.分光光度法的概念分光光度法的概念 利用物质所特有的吸收光谱对物质进行利用物质所特有的吸收光谱对物质进行鉴别和定量测定的方法叫做鉴别和定量测定的方法叫做。2.原理原理1)分光光度法的核心原理分光光度法的核心原理 比色分析法比色分析法 待测物待测物 + 呈色剂呈色剂有色溶液有色溶液以溶液呈色的深浅判断其浓度以溶液呈色的深浅判断其浓度2)分光光度法的核心定律分光光度法的核心定律 Lambert-Beer 定律定律当单色光透过某种有色溶液时当单色光透过某种有色溶液时, , 溶液的光密度溶液的光密度( (OD)与溶液的厚与溶液的厚度和浓度成正比度和浓度成正比. .OD = K L COD光密度值（光密度值（Optic Density)K消光系数消光系数( (为常数为常数) )L溶液厚度溶液厚度C溶液浓度溶液浓度有色溶液有色溶液I I0 0I IaI I反射光反射光分散光分散光 其他因其他因素损失光素损失光则，则，I I0 0= = I Ia + +I I + +反射光反射光分散光分散光+ + + 其他因其他因素损失光素损失光干扰因素干扰因素空白管空白管不含待测样品，且具备其他一切光学因素不含待测样品，且具备其他一切光学因素经空白管校正后：经空白管校正后：I I0 0= = I Ia + + I I则，透光率则，透光率T T = =I II I0 0经空白管校正后，我们可以认经空白管校正后，我们可以认为，透光率为，透光率T T的变化完全取决于的变化完全取决于待测样品含量的多少。待测样品含量的多少。Lambert 定律：定律：当单色光透过某种有色溶液时，透过光强当单色光透过某种有色溶液时，透过光强度随液层厚度增加而指数地减弱。度随液层厚度增加而指数地减弱。I = I0 01010- -KL则，透光率则，透光率T =T =I II I0 0= =I I0 01010-K-KLI I0 0= =1010-K-KL则，光密度则，光密度D = = -T= = -10-KLKL= =Beer 定律：定律：当单色光透过某种有色溶液时，透过光强当单色光透过某种有色溶液时，透过光强度随溶液浓度增加而指数地减弱。度随溶液浓度增加而指数地减弱。I = I0 01010- -KC则，光密度则，光密度D = = KC则，则，Lambert-Beer 定律为：定律为：D = K L C3)3)应用应用 标准曲线法标准曲线法 标准管法标准管法标准曲线法标准曲线法特点：方便、快捷，适用于大批量样品处理特点：方便、快捷，适用于大批量样品处理方法：方法：a.标准曲线绘制标准曲线绘制配制一系列与待测样品溶质相同的，浓配制一系列与待测样品溶质相同的，浓度由小到大的标准溶液，分别测度由小到大的标准溶液，分别测OD值。值。CD0 0 b. 未知样品浓度测定未知样品浓度测定CD0 0DxCx标准管法标准管法特点：相对准确，适用于少量样品处理特点：相对准确，适用于少量样品处理方法：方法：设标准溶液，浓度已知，分别测样品和标准设标准溶液，浓度已知，分别测样品和标准溶液的溶液的OD值。值。D测测 = K L C测测D标准标准 = K L C标准标准C测测=D测测D标准标准 C标准标准4)4)分光光度法的优点分光光度法的优点灵敏：能测定出溶液中含量极少的物质浓度灵敏：能测定出溶液中含量极少的物质浓度准确：误差小，与真实值非常接近准确：误差小，与真实值非常接近快速：操作步骤简单，较少时间内得出结果快速：操作步骤简单，较少时间内得出结果简便：无需从溶液中分离待测样品简便：无需从溶液中分离待测样品5)5)分光光度法所使用的仪器分光光度法所使用的仪器 分光光度计分光光度计 分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构光源光源单色器单色器吸收池吸收池受光器受光器测量器测量器检测系统检测系统分光光度计的分类分光光度计的分类400760nm （可见光）（可见光）200400nm（紫外光）（紫外光）76010,000nm（红外光）（红外光）6)6)分光光度计的使用方法分光光度计的使用方法接通电源，预热接通电源，预热30分钟；分钟；装样；装样；选择波长；选择波长；调零；调零；测定；测定；关闭电源，清洗比色杯。关闭电源，清洗比色杯。实验一实验一 用分光光度法测定血清蛋白含量用分光光度法测定血清蛋白含量实验二实验二 绘制吸收曲线绘制吸收曲线实验一实验一 用分光光度法用分光光度法测定血清蛋白含量测定血清蛋白含量 【实验目的实验目的】1.掌握标准曲线的制备方法和标准管法掌握标准曲线的制备方法和标准管法的计算方法；的计算方法；2. 掌握双缩脲法测定血清蛋白的原理和掌握双缩脲法测定血清蛋白的原理和方法。方法。 【实验原理实验原理】 呈色反应呈色反应茚三酮反应茚三酮反应双缩脲反应双缩脲反应尿素被加热至尿素被加热至 180180左右时，两分子尿素缩合左右时，两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下可与件下可与CuCu2+2+结合生成复杂的紫红色化合物。结合生成复杂的紫红色化合物。此反应称为双缩脲反应。此反应称为双缩脲反应。 【操作方法操作方法】 1. 1. 标准曲线制备：标准曲线制备： 取取6支试管，标注支试管，标注05号，按照下表加入试剂，号，按照下表加入试剂， 混匀，静止混匀，静止30分钟；分钟；标准酪蛋白溶液标准酪蛋白溶液 蒸馏水蒸馏水(ml)双缩脲试剂双缩脲试剂(ml) 0 0 (ml) 2.0 4.0 1 0.4 1.6 4.0 2 0.8 1.2 4.0 3 1.2 0.8 4.0 4 1.6 0.4 4.0试剂试剂管号管号 于于540nm波长下测定各管波长下测定各管OD值；值； 以酪蛋白含量为横坐标，以酪蛋白含量为横坐标，OD值为纵坐标，值为纵坐标，绘制标准曲线；绘制标准曲线； 2. 未知样品浓度测定：未知样品浓度测定： 取取5号管，号管， 吸取吸取1ml （1：10稀释）血清待测样稀释）血清待测样, 用水补足至用水补足至2ml，加入双缩脲试剂，加入双缩脲试剂4ml，混匀后与，混匀后与以上以上4管同时比色，从标准曲线查出其蛋白质浓度，管同时比色，从标准曲线查出其蛋白质浓度，按稀释倍数求出血清原液浓度。按稀释倍数求出血清原液浓度。 3. 标准管法：标准管法： C测测 = = D测测D标标C标标 C原液原液= =C测测（2 + 4）10实验二实验二 绘制吸收曲线绘制吸收曲线【实验目的实验目的】 掌握绘制吸收曲线的掌握绘制吸收曲线的 原理和方法原理和方法【实验原理实验原理】 各种物质都有其独特的吸收光谱。不同物质对各种物质都有其独特的吸收光谱。不同物质对单一色光的吸收程度不同；相同物质对不同波长单一色光的吸收程度不同；相同物质对不同波长单色光的吸收程度也不同。如果利用不同波长的单色光的吸收程度也不同。如果利用不同波长的单色光透射待测物质溶液时，会得到一系列相应单色光透射待测物质溶液时，会得到一系列相应的的OD值，那么：值，那么：l lD此光滑曲线即为该种此光滑曲线即为该种物质的吸收曲线。物质的吸收曲线。 吸收曲线有何意义？吸收曲线有何意义？定性：定性： 测定待测物质的吸收曲线，与已知曲线测定待测物质的吸收曲线，与已知曲线比对，推定该物质是什么，既定性检定；比对，推定该物质是什么，既定性检定；定量定量： 定量测定已知物质时，可选用该物质的定量测定已知物质时，可选用该物质的最大吸收峰波长，达到最佳测量效果。最大吸收峰波长，达到最佳测量效果。【操作方法操作方法】开机预热开机预热30分钟；分钟；装样：以蒸馏水为空白，用装样：以蒸馏水为空白，用0.005%KMnO4 溶液加入另一比色杯；溶液加入另一比色杯；调不同波长测定调不同波长测定OD值：在值：在500570nm 区间测量，每隔区间测量，每隔10nm测量一次，其中测量一次，其中 520540nm之间每隔之间每隔5nm测量一次；测量一次； （注意：每次变动波长需重新调零（注意：每次变动波长需重新调零!）绘制曲线：以绘制曲线：以l l为横坐标，相应为横坐标，相应OD值为纵坐值为纵坐 标，描记各点，连接成光滑曲线；标，描记各点，连接成光滑曲线；查找结果：从曲线上查找吸收最强的单色光查找结果：从曲线上查找吸收最强的单色光波长。波长。实验结束,谢谢!