实验七实验七 SOD SOD检测波长的选检测波长的选择及含量测定择及含量测定SOD检测波长的选择及含量测定一、超氧化物歧化酶的基本特性一、超氧化物歧化酶的基本特性及生理功能及生理功能1 1、超氧化物歧化酶的组成、超氧化物歧化酶的组成 超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SODSuperoxide Dismutase, SOD）是）是一种能催化一种能催化超氧阴离子自由基超氧阴离子自由基发生歧化反应的金属酶，按发生歧化反应的金属酶，按金属辅基不同分为三类：金属辅基不同分为三类： Cu,Zn-SOD Mn-SOD Fe-SOD Cu,Zn-SOD Mn-SOD Fe-SOD 自由基：自由基：是一类非常活跃的化学物质，人体正常的新陈代是一类非常活跃的化学物质，人体正常的新陈代谢就会产生自由基、是人体活动所需要的，但在某些特殊谢就会产生自由基、是人体活动所需要的，但在某些特殊的情况下，体内会产生过量的自由基。它可聚集体在人体的情况下，体内会产生过量的自由基。它可聚集体在人体各组织器官上，导致各种慢性病与老化，故说它是各组织器官上，导致各种慢性病与老化，故说它是 万病万病之源之源 ，是人体健康的大敌。，是人体健康的大敌。 SOD检测波长的选择及含量测定2 2、超氧化物歧化酶的生理功能、超氧化物歧化酶的生理功能（1 1）延缓由于自由基侵害引起的衰老现象）延缓由于自由基侵害引起的衰老现象（2 2）治疗由自由基损伤而诱发的疾病）治疗由自由基损伤而诱发的疾病（3 3）消除肌肉疲劳）消除肌肉疲劳（4 4）提高人体的抵抗力）提高人体的抵抗力SOD检测波长的选择及含量测定蛋白质含量测定方法蛋白质含量测定方法t定氮法定氮法t紫外分光光度法紫外分光光度法t双缩尿法（双缩尿法（BiuretBiuret法）法） tFolinFolin酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）法） t考马斯亮蓝法（考马斯亮蓝法（BradfordBradford法）法） 其中其中BradfordBradford法和法和LowryLowry法法灵敏度最高，比紫外吸收法灵灵敏度最高，比紫外吸收法灵10102020倍，比倍，比BiuretBiuret法灵敏法灵敏100100倍以上。定氮法虽然比较复杂，倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。都有其优缺点。SOD检测波长的选择及含量测定在选择方法时应考虑的几点因素在选择方法时应考虑的几点因素 实验对测定所要求的灵敏度和精确度；实验对测定所要求的灵敏度和精确度； 蛋白质的性质；蛋白质的性质； 溶液中存在的干扰物质；溶液中存在的干扰物质； 测定所要花费的时间。测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（考马斯亮蓝法（BradfordBradford法），由于其法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。突出的优点，正得到越来越广泛的应用。SOD检测波长的选择及含量测定一、紫外分光光度法一、紫外分光光度法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有环含有共轭双键共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在高峰在280nm280nm处，处，其吸光度与蛋白质含量成正比。其吸光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋此外，蛋白质溶液在白质溶液在238nm238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。可以进行蛋白质含量的测定。 此法的特点此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现物质，会出现较大的干扰。较大的干扰。 SOD检测波长的选择及含量测定二、双缩脲法（二、双缩脲法（BiuretBiuret法）法） 双缩脲（双缩脲（NH3CONHCONH3NH3CONHCONH3）是两个分子脲经）是两个分子脲经180180左左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与双缩脲与CuSO4CuSO4形成形成紫色络合物紫色络合物，称为双缩脲反应。凡，称为双缩脲反应。凡具具有两个酰胺基有两个酰胺基（-CONH2-CONH2）或或两个直接连接的肽键两个直接连接的肽键，或能过，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定波长为测定波长为540nm540nm，测定范围为，测定范围为1-10mg1-10mg蛋白质。干扰这一蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、测定的物质主要有：硫酸铵、TrisTris缓冲液和某些氨基酸等。缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。测定。SOD检测波长的选择及含量测定三、三、FolinFolin酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）法） 此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即第二种试剂，即FolinFolin酚试剂，以增加显色量，从而提高酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：碱性条件下，因是：碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。此复合物将此复合物将FolinFolin酚试剂中的磷钼酸盐酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐还原，磷钨酸盐还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。兰色深度与蛋白的量成正比。 这个测定法的优点是这个测定法的优点是灵敏度高灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，比双缩脲法灵敏得多，缺点是缺点是费时间较长费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达此法可检测的最低蛋白质量达5mg5mg。通常测定范围是。通常测定范围是20-20-250mg250mg。SOD检测波长的选择及含量测定四、考马斯亮兰法（四、考马斯亮兰法（BradfordBradford法）法） 19761976年由年由BradfordBradford建立的考马斯亮兰法（建立的考马斯亮兰法（BradfordBradford法）法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（使染料的最大吸收峰的位置（lmaxlmax），由），由465nm465nm变为变为595nm595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合氨基酸残基相结合。在。在595nm595nm下测定的吸光度值下测定的吸光度值A595A595，与蛋，与蛋白质浓度成正比。白质浓度成正比。SOD检测波长的选择及含量测定SODSOD检测波长的选择检测波长的选择及含量测定及含量测定实验目的实验目的掌握掌握掌握掌握SODSODSODSOD检测波长的选择方法检测波长的选择方法检测波长的选择方法检测波长的选择方法学习考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理。学习考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理。学习考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理。学习考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理。掌握掌握掌握掌握考马斯亮兰法考马斯亮兰法考马斯亮兰法考马斯亮兰法测定蛋白质含量的实验测定蛋白质含量的实验测定蛋白质含量的实验测定蛋白质含量的实验技术。技术。技术。技术。 SOD检测波长的选择及含量测定 本本本本实实实实验验验验采采采采用用用用考考考考马马马马斯斯斯斯亮亮亮亮蓝蓝蓝蓝G-250G-250G-250G-250法法法法测测测测定定定定SODSODSODSOD浓浓浓浓度度度度。考考考考马马马马斯斯斯斯亮亮亮亮蓝蓝蓝蓝G-250G-250G-250G-250存存存存在在在在着着着着两两两两种种种种不不不不同同同同的的的的颜颜颜颜色色色色形形形形式式式式，红红红红色色色色和和和和蓝蓝蓝蓝色色色色，它它它它和和和和蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质通通通通过过过过范范范范德德德德华华华华力力力力（Van Van Van Van der der der der wals wals wals wals bondbondbondbond）结结结结合合合合，在在在在一一一一定定定定蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质浓浓浓浓度度度度范范范范围围围围内内内内，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质和和和和染染染染料料料料结结结结合合合合符符符符合合合合比比比比尔尔尔尔定定定定律律律律（Beers Beers Beers Beers lawlawlawlaw）。此此此此染染染染料料料料与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质结结结结合合合合后后后后颜颜颜颜色色色色由由由由红红红红色色色色形形形形式式式式转转转转变变变变成成成成蓝蓝蓝蓝色色色色形形形形式式式式，最最最最大大大大光光光光吸吸吸吸收收收收由由由由465nm465nm465nm465nm变变变变成成成成595nm595nm595nm595nm，通通通通过过过过测测测测定定定定595nm595nm595nm595nm处处处处光光光光吸吸吸吸收收收收的增加量可知与其结合蛋白质的量。的增加量可知与其结合蛋白质的量。的增加量可知与其结合蛋白质的量。的增加量可知与其结合蛋白质的量。 实验原理实验原理SOD检测波长的选择及含量测定仪器：电子天平、紫外分光光度计、小烧杯、容量瓶、仪器：电子天平、紫外分光光度计、小烧杯、容量瓶、仪器：电子天平、紫外分光光度计、小烧杯、容量瓶、仪器：电子天平、紫外分光光度计、小烧杯、容量瓶、 玻璃比色皿、洗瓶、试管、滤纸、擦镜纸玻璃比色皿、洗瓶、试管、滤纸、擦镜纸玻璃比色皿、洗瓶、试管、滤纸、擦镜纸玻璃比色皿、洗瓶、试管、滤纸、擦镜纸 试剂：超氧化物岐化酶试剂：超氧化物岐化酶试剂：超氧化物岐化酶试剂：超氧化物岐化酶 、考马斯亮蓝、考马斯亮蓝、考马斯亮蓝、考马斯亮蓝G-250 G-250 G-250 G-250 、磷酸、磷酸、磷酸、磷酸 、 95 95 95 95乙醇乙醇乙醇乙醇 、NaCl NaCl NaCl NaCl 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝试剂：准确称取考马斯亮蓝准确称取考马斯亮蓝准确称取考马斯亮蓝准确称取考马斯亮蓝G-250 100mgG-250 100mgG-250 100mgG-250 100mg溶于溶于溶于溶于50ml 9550ml 9550ml 9550ml 95乙醇，加入乙醇，加入乙醇，加入乙醇，加入100ml 85100ml 85100ml 85100ml 85磷酸，用蒸馏水稀释至磷酸，用蒸馏水稀释至磷酸，用蒸馏水稀释至磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml1000ml1000ml1000ml，滤纸过，滤纸过，滤纸过，滤纸过滤。最终试剂中含滤。最终试剂中含滤。最终试剂中含滤。最终试剂中含0.010.010.010.01（W/VW/VW/VW/V）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝）考马斯亮蓝G-250G-250G-250G-250，4.74.74.74.7（W/VW/VW/VW/V）乙醇，）乙醇，）乙醇，）乙醇，8.58.58.58.5（W/VW/VW/VW/V）磷酸。）磷酸。）磷酸。）磷酸。仪器与试剂仪器与试剂SOD检测波长的选择及含量测定1.SOD1.SOD检测波长的确定检测波长的确定l准确称取准确称取SODSOD粉末粉末10mg10mg，用，用0.15mol/L NaCl0.15mol/L NaCl配制成配制成1mg/ml1mg/ml蛋白溶液，作为标准储备液蛋白溶液，作为标准储备液。l从上述储备液从上述储备液中吸取两份，每份中吸取两份，每份0.4ml0.4ml，分别放置在，分别放置在试管中，其中一份加入试管中，其中一份加入0.15mol/L NaCl 0.15mol/L NaCl 溶液溶液5ml5ml，摇，摇匀后备用；另一份中先加入匀后备用；另一份中先加入0.15mol/L NaCl 0.15mol/L NaCl 溶液溶液0.6ml0.6ml，再加入，再加入5ml5ml考马斯亮兰试剂，考马斯亮兰试剂，1h1h内以内以0.15mol/L 0.15mol/L NaCl NaCl 溶液为空白分别进行全波长扫描，并记录最大吸溶液为空白分别进行全波长扫描，并记录最大吸收波长。收波长。实验步骤实验步骤SOD检测波长的选择及含量测定2. 2. SODSOD标准曲线的制作标准曲线的制作 t取已配制好的标准储备液取已配制好的标准储备液备用。取备用。取6 6支试管，按下表操作。支试管，按下表操作。试管编号试管编号 0 01 12 23 34 45 51mg/ml SOD1mg/ml SOD溶液溶液 /ml /ml 0 00.20.20.30.30.40.40.50.50.60.60.15mol/L NaCl 0.15mol/L NaCl /ml /ml 1.01.00.80.80.70.70.60.60.50.50.40.4考马斯亮兰试剂考马斯亮兰试剂 /ml /ml 5ml5ml摇匀，摇匀，1h1h内以内以0 0号试管为空白对照，在号试管为空白对照，在595nm595nm处比色处比色 SODSODSODSOD标准曲线标准曲线标准曲线标准曲线SOD检测波长的选择及含量测定3. 3. 样品测定样品测定 精密吸取精密吸取1mg/ml 1mg/ml 的的SODSOD溶液溶液0.35ml0.35ml，再加入，再加入0.65ml0.65ml的的0.15mol/L NaCl0.15mol/L NaCl溶液，混匀后，加入溶液，混匀后，加入5ml5ml考马斯亮蓝试考马斯亮蓝试剂，摇匀，剂，摇匀，1h1h内以内以0 0号试管为空白对照，按上述方法测定号试管为空白对照，按上述方法测定595nm595nm处的吸光度。处的吸光度。平行测定三份，平行测定三份，并记录吸光度数值，计并记录吸光度数值，计算得到平均值。算得到平均值。SOD检测波长的选择及含量测定1. 1. 1. 1. 绘制绘制绘制绘制SODSODSODSOD在染色前后的全波长扫描图谱，并指出最大吸在染色前后的全波长扫描图谱，并指出最大吸在染色前后的全波长扫描图谱，并指出最大吸在染色前后的全波长扫描图谱，并指出最大吸收波长分别是多少。收波长分别是多少。收波长分别是多少。收波长分别是多少。2.2.2.2.以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。3. 3. 3. 3. 根据样品溶液的吸光度，用标准曲线计算出待测蛋白质根据样品溶液的吸光度，用标准曲线计算出待测蛋白质根据样品溶液的吸光度，用标准曲线计算出待测蛋白质根据样品溶液的吸光度，用标准曲线计算出待测蛋白质的含量。的含量。的含量。的含量。实验结果实验结果SOD检测波长的选择及含量测定