Next Generation Sequencing(NGS) 技术简介Sanger Sanger 测序测序Sanger 测序法仍然为基因测序行业内的金标准，但鸟枪测序法在技术上存在瓶颈。（价格昂贵、步骤繁琐、效率低）NGS = Next Generation SequencingNGS = Next Generation SequencingNGS也称为高通量测序High-throughput Sequencing (HTS)第一代测序：Sanger Sequencing （Sanger测序）第二代测序： NGS = Massively Parallel Sequencing （大规模平行测序）第三代测序： NGS = HTS, SingleMolecule Sequencing （高通量、单分子测序）目前目前NGSNGS的主要三种测序仪器的主要三种测序仪器三种测序仪在高通量水平、测序准确度、存储格式和技术方法上均有差异。罗氏/454基因组测序仪FLX系统焦磷酸测序法光学230-400在第二代中最高读长；比第一代的测序通量大样品制备较难；难于处理重复和同种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错误累积；仪器昂贵illuminaHiSeq2000/miSeq可逆链终止物和合成测序法荧光/光学2x150很高测序通量仪器昂贵；用于数据删节和分析的费用很高ABI/SOLiD5500xlSOLiD系统连接测序法荧光/光学25-35很高测序通量；在广为接受的几种第二代平台中，所要拼接出人类基因组的试剂成本最低测序运行时间长；读长短，造成成本高，数据分析困难和基因组拼接困难；仪器昂贵公司公司平台名平台名称称测序方法测序方法 检测方法检测方法大约读大约读长长(碱基碱基数数)优点优点相对局限性相对局限性三大测序平台的技术特点和差异三大测序平台的技术特点和差异Roche 454Roche 454测序原理测序原理Roche 454焦磷酸测序原理Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。一、样品处理一、样品处理Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤二、文库制备二、文库制备文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤三、连接微珠三、连接微珠将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链DNA，通过控制条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤四、四、emRCRemRCRPCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。乳液乳液PCRPCR（emRCRemRCR）Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤五、反应板准备、上机测序五、反应板准备、上机测序454测序的反应板称为PTP（Pico Titer Plate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29m，而测序磁珠的直径为20m，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。Roche 454Roche 454测序步骤测序步骤六、测序和分析六、测序和分析将磁珠与测序试剂加入PTP中，使之可用于上机测序。在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。IlluminaIllumina测序原理测序原理Illumina合成测序原理IlluminaIllumina测序流程测序流程桥式PCR合成法测序数据读取ABI SOLiDABI SOLiD测序原理测序原理ABI SOLiD连接测序原理ABI SOLiDABI SOLiD测序流程测序流程制备DNA文库乳液PCR/微珠富集连接酶测序:SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。这样经过五轮测序反应后便可以得到所有的碱基序列SOLID的双碱基编码矩阵ABI SOLiD连接测序原理探针的5末端标记了1种颜色的荧光染料。探针3端15位为随机碱基，其中第1、2位构成的碱基对表征探针染料类型，而35位的“n”为随机碱基，68位的“z” 是可以和任何碱基配对的特殊碱基。SOLiD测序反应的每一轮测序反应会连接第15位的碱基，同时切除第68位的碱基，同时记录下第12位碱基决定的荧光颜色。ABI SOLiD连接测序原理ABI SOLiD连接测序原理两个碱基共同决定一个颜色，可以极大的提高测序的准确率。ABI SOLiD连接测序原理五轮测序反应反应后，按照第0、1位，第1、2位. 的顺序把对应于模板序列的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3”组成的SOLiD原始颜色序列。454平台的突出优势是读长。目前454系统的序列读长已超过400 bp。虽然454平台的测序成本比其他平台要高很多，不过对于那些需要长读长的应用，如从头拼接和环境微生物组学，它仍是最理想的选择。 各个测序平台的特点总结Roche 454Illumina1. 可可扩展的超高通量展的超高通量Genome Analyzer系统目前每次运行后可获得超过20 GB的高品质过滤数据。经优化后通量还有望上升到95 GB，相当于人类基因组的30倍覆盖度。2. 需要需要样品量少品量少Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，能应用在很多样品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。3. 简单、快速、自、快速、自动化化Genome Analyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程。制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。自动化的流程不减少了手工操作误差和污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。1. 无以无以伦比的通量比的通量 目前SOLiD 3系统单次运行能产生50 GB的人基因组序列数据，相当于基因组的17倍覆盖度，这显然是其他任一台新一代测序系统都无法达到的2. 准确性。准确性。 新的超精确检测模块（ECC模块）将提供高达99.99%的精确性；多达98%的可定位碱基的质量值高于45；更多标签以提高灵敏度和动态范围；高准确性的原始读序，支持无参考序列的数据分析。 各个测序平台的特点总结ABI SOLiD公司公司平台名平台名称称测序方法测序方法检测方检测方法法大约读大约读长长(碱基碱基数数)优点优点相对局限性相对局限性太平洋生物科学公司（PacBio）PacBio RS实时单分子DNA测序荧光/光学1000高平均读长，比第一代的测序时间降低；不需要扩增；最长单个读长接近3000碱基并不能高效地将DNA聚合酶加到测序阵列中；准确性一次性达标的机会低（81-83%）；DNA聚合酶在阵列中降解；总体上每个碱基测序成本高（仪器昂贵）；Complete GenomicsGeXP遗传分析系统复合探针锚杂交和连接技术荧光/光学10在第三代中通量最高；在所有测序技术中，用于拼接一个人基因组的试剂成本最低；每个测序步骤独立，使错误的累积变得最低低读长； 模板制备妨碍长重复序列区域测序；样品制备费事；尚无商业化供应的仪器Ion Torrent/Life Technology个人基因组测序仪（PGM） 合成测序法以离子敏感场效应晶体管检测pH值变化100-200对核酸碱基的掺入可直接测定；在自然条件下进行DNA合成（不需要使用修饰过的碱基）一步步的洗脱过程可导致错误累积；阅读高重复和同种多聚序列时有潜在困难；第三代测序平台的比较差异太平洋生物科学公司（PacBios）实时单分子测序方案示意图。A. 单个零点启动模式波导纳米结构的侧面图， 每个纳米结构含一个DNA聚合酶分子，固定于底部的玻璃面上。波导纳米结构和共焦成像系统确保只对底部进行荧光检测。 B. 显示了荧光标记的核苷酸底物掺入测序模板的过程。相应的瞬时荧光探测分为5个步骤。太平洋生物科学公司Life Technology公司IonTorrent半导体测序芯片技术图示。A. 该芯片结构设计的逐层显示图。上层为单个的DNA聚合反应的微池，底部两层构成场效应晶体管离子传感器。每个微池有其相对应的场效应晶体管探头，以鉴别每一个pH值的变化。B. 侧面图：微池中，DNA聚合酶将两个重复的TTP核苷酸掺入测序片段中。反应过程中释放出的氢离子被下方的场效应晶体管检测到。Complete Genomics公司Complete Genomics公司的DNB阵列生产和cPAL技术的方案示意图。A.待测片段的设计，DNA纳米球的合成，用来放置纳米球规则排列的纳米阵列-这些可以显示DNA纳米球阵列的形成过程； B. 图示：用对应于一个独特接头位点的5个碱基的一组普通探针进行测序过程。图中也显示了标准锚定序列和延伸锚定序列。