1第四章第四章抗菌药物敏感试验抗菌药物敏感试验2主主 要要 内内 容容n抗菌药物敏感性概述抗菌药物敏感性概述n抗菌药物敏感性试验方法抗菌药物敏感性试验方法n全国全国“细菌耐药监测网细菌耐药监测网”简介简介3敏感和耐药的概念敏感和耐药的概念n从从本本质质上上讲讲：细细菌菌对对某某种种抗抗菌菌药药物物是是敏敏感感还还是是耐耐药药，常常以以该该抗抗菌菌药药物物的的治治疗疗浓浓度度与与MIC的的关关系系而而定。定。常用剂量的抗菌药物通过常常用剂量的抗菌药物通过常用途径所能达到的用途径所能达到的血药浓度血药浓度4血药浓度与血药浓度与MIC之间的关系之间的关系敏感敏感中介耐药中介耐药耐药耐药上限上限下限下限5 抗菌药物的抗菌药物的治疗浓度治疗浓度与与MIC的关系：的关系：n若若MIC小于小于治疗浓度，治疗浓度， 则为则为“敏感敏感”（Sensitive , S ），推荐使用。），推荐使用。n若若MIC大于大于治疗浓度，治疗浓度， 则为则为“耐药耐药”（ Resistant , R ）；）；n若若MIC介于治疗浓度的上下限之间介于治疗浓度的上下限之间， 则则为为“中中度度耐耐药药”（ Intermediate , I ）或或中中度度敏敏感感敏感和耐药的概念敏感和耐药的概念67敏感敏感治疗浓度的上限治疗浓度的上限即表中的即表中的 R治疗浓度的下限治疗浓度的下限即表中的即表中的 S耐药耐药中介中介耐药耐药治疗浓度治疗浓度CLSI标准标准MIC8 第一节、第一节、抗菌药物敏感性试验方法抗菌药物敏感性试验方法需氧和兼性厌氧菌需氧和兼性厌氧菌9n稀释法稀释法 肉汤稀释法（试管稀释法）肉汤稀释法（试管稀释法） 琼脂稀释法（平板稀释法）琼脂稀释法（平板稀释法）n纸片扩散法（纸片法）纸片扩散法（纸片法） nE-试验试验n联合药物敏感试验联合药物敏感试验需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法10稀释法的特点稀释法的特点n定量定量的药敏试验，的药敏试验，测定测定MIC、MBC。n方法比较繁琐，手工操作一般不作为常规试验，方法比较繁琐，手工操作一般不作为常规试验，常用于调查罕见耐药。常用于调查罕见耐药。n自动微生物鉴定药敏分析系统自动微生物鉴定药敏分析系统采用微量稀释法采用微量稀释法检测检测MIC。11二、纸片扩散法（disc diffusion test) （Kirby-Bauer法） 原理：原理：n将将浸有抗菌药物的纸片浸有抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平贴在涂有测试菌的琼脂平板上。抗菌药物向琼脂四周扩散形成板上。抗菌药物向琼脂四周扩散形成递减的梯度递减的梯度浓度浓度。n药物敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到药物敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，形成抑制，形成抑菌圈抑菌圈。n抑菌圈的大小反映测试菌抑菌圈的大小反映测试菌 对对药物的敏感程度药物的敏感程度。 二者呈正相关。二者呈正相关。12抑菌圈边缘的药物浓度抑菌圈边缘的药物浓度 与与 MIC13 抑菌圈的大小与抑菌圈的大小与MICMIC：n二者呈负相关，即抑菌圈愈大，二者呈负相关，即抑菌圈愈大，MICMIC愈小。愈小。14纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准纸片法药敏试验抑菌圈直径与结果解释的标准抗菌药物与细菌抗菌药物与细菌 纸片含量纸片含量 抑菌圈直径抑菌圈直径：mm 相应相应MIC g/ml 耐药耐药 中介度中介度 敏感敏感 耐药耐药 敏感敏感丁胺卡那霉素丁胺卡那霉素 30g 14 15-16 17 32 16 氨苄青霉素氨苄青霉素 测肠杆菌测肠杆菌 10g 11 12-13 14 32 8 测葡萄球菌测葡萄球菌 10g 28 29 测嗜血杆菌测嗜血杆菌 10g 19 20 4 0.25 测肠球菌测肠球菌 10g 16 16 215 操作方法操作方法 ：1. 制备制备M-H琼脂平板，厚度琼脂平板，厚度4mm。2 .制备制备0.5麦氏麦氏比浊管浊度的菌液比浊管浊度的菌液（培养（培养1624h，45个菌落）。个菌落）。3. 菌液均匀涂布于平板。（菌液均匀涂布于平板。（15分钟接种完毕）分钟接种完毕）4. 无菌贴标准抗生素纸片于无菌贴标准抗生素纸片于M-H琼脂表面，琼脂表面， 5. 经过经过351624h孵育。孵育。6. 量取抑菌环直径量取抑菌环直径， 根据根据CLSI标准，标准， 报告细菌对该抗生素敏感、报告细菌对该抗生素敏感、 耐药、中介耐药、中介。16操作方法操作方法 ：1. 将在约将在约56恒温的无菌恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为琼脂倾注直径为90mm 的平板，其厚度的平板，其厚度 4mm。172.无菌挑取孵育无菌挑取孵育1624h的血平板上的血平板上45个菌落。个菌落。183. 将菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度于将菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度于0.5麦氏麦氏比浊管浊度的菌液。比浊管浊度的菌液。1.5108CFU /ml194.用无菌棉签浸入细菌悬用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在液。棉签在三个方向均匀三个方向均匀抹抹琼脂表面（每次转琼脂表面（每次转60）使菌液均匀分布，）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。最后沿平板内缘涂抹一周。 205.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置310分钟分钟后贴上标准抗生素纸片。后贴上标准抗生素纸片。 216. .用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-HM-H琼脂琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于心距离应大于24mm24mm，纸片距平板内缘应大于，纸片距平板内缘应大于15mm15mm。227.7.经过经过3516351624h24h孵育。孵育。8.8.取抑菌环直径，取抑菌环直径，根据根据CLSICLSI标准，报告细菌对标准，报告细菌对该抗生素敏感、耐药、中介。该抗生素敏感、耐药、中介。 23纸片扩散法纸片扩散法质量控制质量控制n 培养基：培养基：M-H平板厚度，平板厚度，4 mm n细菌悬液：细菌悬液：0.5麦氏标准的细菌浓度麦氏标准的细菌浓度n药敏纸片的质量药敏纸片的质量n各抗菌纸片中心距离应大于各抗菌纸片中心距离应大于24mm， 纸片距平板内缘应大于纸片距平板内缘应大于15mm。 9cm的平板贴的平板贴6个个n培养时间培养时间n质控菌株质控菌株 抑菌圈直径？抑菌圈直径？ 2425n根据抑菌圈的直径，依照根据抑菌圈的直径，依照CLSI标准，作出敏感、标准，作出敏感、耐药、和中介的判断。为耐药、和中介的判断。为 定性定性”结果。结果。nCLSI推荐的最简单的药敏试验。推荐的最简单的药敏试验。纸片扩散法的特点纸片扩散法的特点26三、三、E试验法试验法（浓度梯度法）（浓度梯度法） 原理：原理：nE E试条是试条是一条一条5mm5mm50mm50mm无孔无孔试剂载体试剂载体，一面固定有，一面固定有一系列预先制备的一系列预先制备的浓度呈连续指数增长的抗菌药物浓度呈连续指数增长的抗菌药物，另一面有判别的另一面有判别的刻度刻度。抗菌药物的梯度可覆盖有。抗菌药物的梯度可覆盖有15-15- -2020个对倍稀释浓度个对倍稀释浓度的宽度范围。的宽度范围。n将将E E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育，围试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的MICMIC。n依照依照CLSICLSI标准判断其敏感、耐药、中介。标准判断其敏感、耐药、中介。 256128 801627无菌生长区无菌生长区有菌生长区有菌生长区28 椭圆形细菌椭圆形细菌生长抑制区生长抑制区256128 8016判读抑菌浓度判读抑菌浓度（MIC ug/ml)31E test 法法特点特点n优点优点q连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好（相关系数为（相关系数为0.9）.可测可测MIC。q操作简单，影响因素少，稳定性高。操作简单，影响因素少，稳定性高。n缺点：缺点：E试条较昂贵试条较昂贵; 不适用于生长缓慢的苛养菌。不适用于生长缓慢的苛养菌。32n用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治疗疗,以扩大病原治疗的覆盖面以扩大病原治疗的覆盖面n治疗多种细菌所引起的混合感染治疗多种细菌所引起的混合感染n对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用n减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生n避免药物达到毒性剂量。避免药物达到毒性剂量。 四、联合药物敏感试验四、联合药物敏感试验联合药物意义联合药物意义33n增强作用：增强作用：两种抗生素联用的效果两种抗生素联用的效果大于大于它们单它们单独使用时的效果之和；独使用时的效果之和； 2025n相加作用相加作用：它们联用时的效果：它们联用时的效果等于等于单用两种抗单用两种抗生素效果之和；生素效果之和； 6070n无关作用：无关作用：两种抗生素联用的效果，两种抗生素联用的效果，仅相当于仅相当于其中一种其中一种具有较强作用的抗生素的效果；具有较强作用的抗生素的效果；n拮抗作用：拮抗作用：两种抗生素联用时的效果两种抗生素联用时的效果反而小于反而小于它们分别使用时的效果之和。它们分别使用时的效果之和。 1015两种药物的联合使用的效果两种药物的联合使用的效果34 两种抗菌药物作用部位不同：两种抗菌药物作用部位不同：n内酰胺类抗生素（抑制细菌细胞壁合成）与内酰胺类抗生素（抑制细菌细胞壁合成）与氨基糖苷类抗生素（干扰细菌的代谢）。氨基糖苷类抗生素（干扰细菌的代谢）。 增强作用：增强作用：增加了药物进入细菌细胞增加了药物进入细菌细胞n杆菌肽（降低细胞通透性）与氨基糖苷类药物杆菌肽（降低细胞通透性）与氨基糖苷类药物（干扰细菌的代谢）。（干扰细菌的代谢）。 拮抗作用：拮抗作用：降低了药物进入细菌细胞降低了药物进入细菌细胞抗菌药物协同作用发生原理抗菌药物协同作用发生原理35n棋盘稀释法棋盘稀释法 利用肉汤稀释法原理，依据两种药物的利用肉汤稀释法原理，依据两种药物的MICMIC， 以棋盘设计两种药物不同浓度的组合。以棋盘设计两种药物不同浓度的组合。n计算抑菌浓度指数（计算抑菌浓度指数（fraction inhaibitory concentration,FIC)联合药物敏感试验方法联合药物敏感试验方法36棋盘稀释法棋盘稀释法n首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的MICMIC。n药物最高浓度为药物最高浓度为MICMIC的的2 2倍，对倍稀释。倍，对倍稀释。n两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。药物混合液。n接种菌量为接种菌量为5 510105 5CUFCUFmlml，3535孵育孵育18h18h后观察后观察结果。结果。n计算部分抑菌浓度（计算部分抑菌浓度（FICFIC）指数。）指数。37抑菌浓度指数（抑菌浓度指数（FICFIC）FIC FIC A药联合时的药联合时的MICA药单测的药单测的MICB药联合时的药联合时的MICB药单测的药单测的MIC FIC 0.5为协同作用；为协同作用； 0.51为相加作用；为相加作用； 12为无关作用；为无关作用； 2 为拮抗作用为拮抗作用38A药：药：32 16 8 4B药药: 16 8 4 2生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长生长 生生 长长39药敏试验方法的比较药敏试验方法的比较nK-B法：法： WTO推荐使用的最简单的推荐使用的最简单的定性药敏定性药敏试验试验。n稀释法：稀释法：准确测定准确测定MIC、 MBC，比较繁琐，比较繁琐， 试管法一般不作为常规试验。试管法一般不作为常规试验。 微生物自动分析系统采用微量稀释法原理微生物自动分析系统采用微量稀释法原理。nE试验：试验：可测定可测定MIC。40第二节第二节 结核分枝杆菌的药敏试验结核分枝杆菌的药敏试验 （了解）（了解）n首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于首次分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于合理用药和监测药物敏感性。合理用药和监测药物敏感性。n另外经过三个月正规治疗，标本分离培养仍另外经过三个月正规治疗，标本分离培养仍为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性为阳性患者，或感染的严重疾患（如播散性结核病和结核性脑膜炎）。结核病和结核性脑膜炎）。n以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外以及来自高耐药流行区的患者，均须做体外药敏试验。药敏试验。41四种方法四种方法n比例法比例法n放射同位素法放射同位素法n绝对浓度法绝对浓度法n耐药率法耐药率法直接法：直接采用图片阳直接法：直接采用图片阳性的体液标本。（须经充性的体液标本。（须经充分消化五杂菌）分消化五杂菌）间接法：经分离纯培养后间接法：经分离纯培养后的次代培养菌。的次代培养菌。42无药药2药3药1nMiddlebrook7H10琼脂琼脂n培养培养3周周间接比例法（间接比例法（WHO推荐）推荐）敏感：含药格无结核杆菌生长，敏感：含药格无结核杆菌生长， 或菌落数或菌落数1%对照格对照格耐药：含药格菌落数耐药：含药格菌落数1%对照格。对照格。不含药的对照格菌落数应为不含药的对照格菌落数应为501504 格平板格平板43分枝杆菌微量直视分枝杆菌微量直视快速药敏试验法快速药敏试验法4000 倍倍44培养培养72h72h观察结果观察结果INHINH敏感敏感RFPRFP耐药耐药阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照45第三节第三节 厌氧菌体外药敏试验厌氧菌体外药敏试验 （了解）（了解）n厌氧菌感染多为内源性感染，厌氧菌药物敏感性稳厌氧菌感染多为内源性感染，厌氧菌药物敏感性稳定，一般不做体外药敏试验。定，一般不做体外药敏试验。n下述情况应考虑药敏试验：下述情况应考虑药敏试验： 明确厌氧菌引起的严重感染；明确厌氧菌引起的严重感染； 已确证的厌氧菌感染，经验性选药治疗未能奏效；已确证的厌氧菌感染，经验性选药治疗未能奏效； 需长期用药的厌氧菌感染。需长期用药的厌氧菌感染。46n基本原理和方法与需氧菌相同，只是在培养基、基本原理和方法与需氧菌相同，只是在培养基、操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需操作环境和培养条件等应根据厌氧菌的特定需要变动。要变动。n培养基为布氏血琼脂再加人补充剂培养基为布氏血琼脂再加人补充剂 5g/ml氯氯化血红素，化血红素，5脱纤维羊脱纤维羊,1g/ml Vit K。n厌氧孵育条件厌氧孵育条件n质控菌株为脆弱类杆菌质控菌株为脆弱类杆菌ATCC25285。 厌氧菌体外药敏试验厌氧菌体外药敏试验47药敏试验结果的临床价值药敏试验结果的临床价值 n影响抗菌药物临床疗效的因素很多，据报道药影响抗菌药物临床疗效的因素很多，据报道药敏试验结果与临床疗效的敏试验结果与临床疗效的符合率约为符合率约为70%70% ，n因此细菌培养及药敏试验报告只能作为临床用因此细菌培养及药敏试验报告只能作为临床用药的参考，应根据患者用药后的治疗反应和临药的参考，应根据患者用药后的治疗反应和临床病情及时调整用药。床病情及时调整用药。n医学检验的灵魂是与临床沟通。医学检验的灵魂是与临床沟通。48新的药敏试验方法探索新的药敏试验方法探索n流式细胞术检测抗生素最低抑菌浓度流式细胞术检测抗生素最低抑菌浓度n分枝杆菌药物最低抑菌浓度的快速测定分枝杆菌药物最低抑菌浓度的快速测定方法研究方法研究49细菌耐药性的发生过程：细菌耐药性的发生过程：细菌获得与耐药相关的基因细菌获得与耐药相关的基因编码与耐药有关的蛋白编码与耐药有关的蛋白表现出对某种抗生素的耐药表现出对某种抗生素的耐药 基因：基因：537表型：书表型：书533页页敏感性敏感性50第第3535章第三节章第三节细菌耐药性检测细菌耐药性检测51n生物化学技术检测生物化学技术检测酶酶的等电点的等电点( (等电聚焦电泳等电聚焦电泳) )n头孢哨噻吩滤纸片法头孢哨噻吩滤纸片法n碘淀粉测定法碘淀粉测定法n分析酶的底物谱及抑制物谱分析酶的底物谱及抑制物谱 纸片法和稀释法纸片法和稀释法 1、-内酰胺酶检测内酰胺酶检测临床意义：产临床意义：产ESBL克雷伯菌和大肠埃希菌克雷伯菌和大肠埃希菌对青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无效。对青霉素、头孢菌素和氨曲南治疗无效。一、耐药表型检测一、耐药表型检测52G-菌产生的头孢菌素酶检测菌产生的头孢菌素酶检测 -头孢哨噻吩滤纸片法头孢哨噻吩滤纸片法 n用接种环挑取受试菌于用接种环挑取受试菌于头孢哨噻吩（产色头孢头孢哨噻吩（产色头孢菌素）菌素）滤纸片上滤纸片上( (商品化商品化) )，n1010分钟内由浅黄色转变为粉红色即阳性结果，分钟内由浅黄色转变为粉红色即阳性结果， 表示头孢菌素的表示头孢菌素的-内酰胺环被酶打开。内酰胺环被酶打开。n临床意义：产生该酶的细菌对头孢菌素类抗生临床意义：产生该酶的细菌对头孢菌素类抗生素耐药。素耐药。53G+菌产生的菌产生的青霉素酶检测青霉素酶检测 -碘淀粉测定法碘淀粉测定法 受试菌混于青霉素溶液，振摇受试菌混于青霉素溶液，振摇3030分钟。加入淀分钟。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液变蓝，继续振摇。粉液后，再加入碘液，溶液变蓝，继续振摇。 1010分钟之内蓝色消失者为产酶株。分钟之内蓝色消失者为产酶株。青霉素酶青霉素酶青霉素青霉素青霉素噻唑酸青霉素噻唑酸碘碘碘淀粉复合物碘淀粉复合物变为无色变为无色 多为金黄色葡萄球菌产生，对青霉素多为金黄色葡萄球菌产生，对青霉素G G耐药。耐药。54超广谱超广谱- -内酰胺内酰胺酶酶Extended-Spectyum-Lactamase，ESBL ESBLsn能水解青霉素类，头孢菌素和氨曲南。能水解青霉素类，头孢菌素和氨曲南。 不能水解碳青烯酶类，如亚胺培南不能水解碳青烯酶类，如亚胺培南n多数可被多数可被内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸，三内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。唑巴坦及舒巴坦）所抑制。n如为如为ESBLESBL阳性，则对阳性，则对青霉素类，头孢菌素和氨青霉素类，头孢菌素和氨曲南均曲南均报告报告耐药，不考虑体外药敏结果。耐药，不考虑体外药敏结果。55常见常见产产ESBLs菌株菌株n最常见最常见是肠杆菌科细菌（是肠杆菌科细菌（大肠埃希氏菌、肺大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌）炎克雷伯氏菌）；n其次，阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、弗劳地其次，阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、弗劳地枸橼酸菌、铜绿假单胞菌、枸橼酸菌、铜绿假单胞菌、奈瑟菌等奈瑟菌等。 56ESBLs的临床意义的临床意义n对产对产ESBLs菌株，目前最有效的抗生素为碳青菌株，目前最有效的抗生素为碳青霉烯类（泰能），其次，头孢西丁及含酶抑制霉烯类（泰能），其次，头孢西丁及含酶抑制剂的复合剂、氨基糖甙类部分有效。剂的复合剂、氨基糖甙类部分有效。n若临床出现产若临床出现产ESBLs菌株，会在病人和医院之菌株，会在病人和医院之间及不同菌株间相互传播，应引起充分的重视。间及不同菌株间相互传播，应引起充分的重视。57纸片初筛：纸片初筛：n培养基：培养基：Muller-HintonMuller-Hinton琼脂琼脂n药敏纸片药敏纸片n接种：按标准纸片扩散法接种：按标准纸片扩散法n孵育：孵育： 3535大气环境，大气环境，16-1816-18小时小时n结果：结果： 头孢泊肟（头孢泊肟（10ug10ug片）抑菌环片）抑菌环22mm 22mm 头孢他啶（头孢他啶（10ug10ug片）抑菌环片）抑菌环22mm22mm 氨曲南氨曲南 （30ug30ug片）抑菌环片）抑菌环27mm27mm 头孢噻肟（头孢噻肟（30ug30ug片）抑菌环片）抑菌环27mm27mm 头孢曲松（头孢曲松（30ug30ug片）抑菌环片）抑菌环25mm 25mm 超超-内酰胺酶检测内酰胺酶检测纸片扩散法纸片扩散法ESBLs的底物的底物可能产生可能产生ESBLs58 n培养基：培养基：Muller-HintonMuller-Hinton琼脂琼脂n药敏纸片浓度：药敏纸片浓度： 头孢噻肟头孢噻肟30ug30ug、头孢噻肟头孢噻肟/ /克拉维酸克拉维酸30ug/10ug30ug/10ug 头孢他啶头孢他啶30ug30ug、头孢他啶头孢他啶/ /克拉维酸克拉维酸30ug/10ug30ug/10ugn接种：按标准纸片扩散法接种：按标准纸片扩散法n孵育：孵育：3535大气环境，大气环境，16-1816-18小时小时 n结果：结果：复合制剂药物纸片的抑菌圈直径复合制剂药物纸片的抑菌圈直径 比非复合制剂药物纸片的直径比非复合制剂药物纸片的直径 5mm5mm 以上者为产以上者为产ESBLsESBLs菌。菌。ESBLs的底物的底物ESBLs的抑制剂的抑制剂(1)纸片确证试验：纸片确证试验：59混合克拉维酸药物混合克拉维酸药物纸片纸片无无克拉维酸克拉维酸药物纸药物纸片的直径片的直径直径差直径差5 mm ：ESBL60 筛选试验：筛选试验：n选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或选用头孢泊肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟或头孢曲松至少头孢曲松至少2种以上，种以上，n用标准肉汤稀释法稀释至用标准肉汤稀释法稀释至1g/ml,n凡被测菌在上述各管中能够生长凡被测菌在上述各管中能够生长(MIC2g/ml)，高度怀疑为高度怀疑为ESBLs，应进一步作确认试验来加以，应进一步作确认试验来加以确诊。确诊。（2）液体稀释法）液体稀释法61 确认试验：确认试验：n用标准肉汤稀释法测定用标准肉汤稀释法测定MIC的方法的方法, n头孢噻肟单独稀释头孢噻肟单独稀释(0.2564g/ml)及及 头孢噻肟头孢噻肟(稀释范围相同稀释范围相同)加克拉维酸加克拉维酸(每管每管4g/ml); 头孢他啶单独稀释头孢他啶单独稀释(0.25128g/ml)及及 头孢他啶加克拉维酸头孢他啶加克拉维酸(每管每管4g/ml), 上述上述2种药物必须同时进行试验种药物必须同时进行试验,n结果加克拉维酸和不加克拉维酸的结果加克拉维酸和不加克拉维酸的 MIC差值差值8倍倍(3个稀释度个稀释度)，可确认为，可确认为ESBLs菌株。菌株。（2）液体稀释法）液体稀释法62二、细菌耐药基因检测二、细菌耐药基因检测n基因检测方法检测细菌耐药性的优缺点基因检测方法检测细菌耐药性的优缺点n抗生素耐药性的基因检测方法抗生素耐药性的基因检测方法n基因检测方法的应用基因检测方法的应用63基因检测细菌耐药性的优点：基因检测细菌耐药性的优点：n能早期指导临床医生治疗用药。能早期指导临床医生治疗用药。 分子遗传学方法可以直接从临床标本入手，无需分子遗传学方法可以直接从临床标本入手，无需菌株的培养，极大地节省时间菌株的培养，极大地节省时间 ， 减轻实验室生物危险性。减轻实验室生物危险性。n有助鉴别那些处于中介水平或常规药敏结果模棱有助鉴别那些处于中介水平或常规药敏结果模棱两可的结果。两可的结果。分子生物学方法被认为是分子生物学方法被认为是“ 金标准金标准” 。n在细菌耐药性的流行病追踪调研中，耐药基因检在细菌耐药性的流行病追踪调研中，耐药基因检测比抗生素敏感方法更准确。测比抗生素敏感方法更准确。n发现新的耐药基因。发现新的耐药基因。64基因检测方法检测抗生素耐药性的缺点：基因检测方法检测抗生素耐药性的缺点：n当样品中菌量很少时，其敏感性会大大降低。当样品中菌量很少时，其敏感性会大大降低。n对每一个测试的抗菌药物，均需要设计相应的分对每一个测试的抗菌药物，均需要设计相应的分子检测方法，一次只能检测一种耐药机制。子检测方法，一次只能检测一种耐药机制。n目前仍有许多耐药机制是未知的，无法进行分子目前仍有许多耐药机制是未知的，无法进行分子检测。检测。n耐药基因的检测也会存在假阳性问题。耐药基因的检测也会存在假阳性问题。n对许多耐药基因的检测方法，对许多耐药基因的检测方法，目前还缺乏临床对目前还缺乏临床对照研究以评价其准确性、重复性及临床应用价值。照研究以评价其准确性、重复性及临床应用价值。65常见的细菌耐药相关基因举例常见的细菌耐药相关基因举例基基 因因耐药抗生素耐药抗生素细菌种类细菌种类基因大小基因大小bpbpAnt(4Ant(4）氨基糖苷类氨基糖苷类金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌473473antant（6 6)-la )-la 氨基糖苷类氨基糖苷类粪肠球菌粪肠球菌470470mec Amec A内酰胺类内酰胺类金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌400400blaTEM blaTEM 一内酰胺类一内酰胺类大肠埃希菌大肠埃希菌424 424 cat Dcat D氯霉素氯霉素艰难杆菌艰难杆菌27027066耐药基因检测方法：耐药基因检测方法：n分子方法检测耐药基因的基础是分子方法检测耐药基因的基础是 PCR。n在在 PCR基础上发展的方法：基础上发展的方法： 分子杂交、分子杂交、 DNA序列分析，序列分析， 基因微振列技术等。基因微振列技术等。 67PCR-序列特异性引物扩增序列特异性引物扩增耐药基因耐药基因标标标标 本本本本提取提取提取提取DNADNAPCRPCR扩增目扩增目扩增目扩增目的基因的基因的基因的基因DNADNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳结果分析结果分析结果分析结果分析 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 耐药基因的的耐药基因的的特异性引物特异性引物n理想的靶序列应当是耐药基因的编码区域，而非编码区外理想的靶序列应当是耐药基因的编码区域，而非编码区外的基因的基因( 如插入序列或启动子序列如插入序列或启动子序列) 。n特异性高，需要设立阴性对照。特异性高，需要设立阴性对照。68基因芯片技术基因芯片技术n芯片制备：以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩芯片制备：以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或阵的方法将寡核苷酸片段或cDNAcDNA作为探针按顺序排列在载作为探针按顺序排列在载体上。体上。n样品制备：生物样品往往是复杂的生物分子混合体，须将样品制备：生物样品往往是复杂的生物分子混合体，须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNADNA、RNARNA，然，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。 n杂交反应：即荧光标记的样品与芯片上的探针进行反应产杂交反应：即荧光标记的样品与芯片上的探针进行反应产生一系列信息的过程。生一系列信息的过程。n信号检测和结果分析：杂交反应后的芯片上各个反应点的信号检测和结果分析：杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。 69结核菌耐药基因突变检测液芯结核菌耐药基因突变检测液芯70“细菌耐药监测网细菌耐药监测网”简介简介监测从住院、门诊病人分离的细菌耐药状况。监测从住院、门诊病人分离的细菌耐药状况。分析住院病人抗菌药物的使用情况和门诊药品的分析住院病人抗菌药物的使用情况和门诊药品的使用情况。使用情况。 系统、连续地收集资料，定量分析、报告系统、连续地收集资料，定量分析、报告抗菌药抗菌药物敏感性、耐药性的发生和分布物敏感性、耐药性的发生和分布，为制定、评估诊，为制定、评估诊疗指南，如经验性治疗方案、感染控制措施等，提疗指南，如经验性治疗方案、感染控制措施等，提供有用信息。供有用信息。7172网上细菌耐药检测检索网上细菌耐药检测检索73广东医学院附属医院细菌耐药性分析广东医学院附属医院细菌耐药性分析n2009年上半年我院细菌培养耐药性分析年上半年我院细菌培养耐药性分析n2009年上半年全院各类标本主要病原菌的耐药年上半年全院各类标本主要病原菌的耐药性性 痰标本主要病原菌的耐药性痰标本主要病原菌的耐药性 尿标本主要病原菌的耐药性尿标本主要病原菌的耐药性 血液标本主要病原菌的耐药性血液标本主要病原菌的耐药性n多重耐药菌株医院感染监控制度多重耐药菌株医院感染监控制度？临床科室更加直观地对自己科室感染细菌？临床科室更加直观地对自己科室感染细菌的耐药性情况有直接的了解。的耐药性情况有直接的了解。某一科室某一科室 主要病原菌的耐药性主要病原菌的耐药性 某某类标本主要病原菌的耐药性类标本主要病原菌的耐药性 某一细菌的耐药情况某一细菌的耐药情况 细菌耐药性分析趋势细菌耐药性分析趋势74细菌耐药细菌耐药 小结小结n举例说明抗菌药物的作用机制。举例说明抗菌药物的作用机制。n举例说明细菌耐药的生化机制。举例说明细菌耐药的生化机制。 分析抗菌药物的作用及细菌对抗菌药物分析抗菌药物的作用及细菌对抗菌药物耐药的相关性。耐药的相关性。n简述简述内酰胺类抗生素的杀菌机制及细内酰胺类抗生素的杀菌机制及细菌对该类药物的耐药机制。菌对该类药物的耐药机制。BPPESBLs75n细菌细菌获得性耐药产生的机制获得性耐药产生的机制 基因突变，获得外源基因（，）基因突变，获得外源基因（，）n说明质粒、整合子、转座子在细菌耐药播散中说明质粒、整合子、转座子在细菌耐药播散中的作用。的作用。n药物敏感试验的意义、方法及特点。药物敏感试验的意义、方法及特点。n联合用药可能出现的结果联合用药可能出现的结果n质量控制质量控制n解释名词：解释名词：AST，MIC，MBC，S，R，I，Tn76