实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 分子生物学技术平台 江燕琼提纲：提纲：n实时荧光定量PCR原理 数学原理 化学原理n实时荧光定量PCR的方法应用 绝对定量 相对定量n定量PCR的实验要素n平台定量PCR仪器介绍实时荧光定量PCR定义定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。与普通与普通PCR的区别的区别n普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。n实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。n荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。n每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 定量PCR的数学原理斜率与扩增效率荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan1、SYBR Green 法SYBR Green 熔解曲线分析SYBR Green法优缺点n优点:n对DNA模板没有选择性n适用于任何DNAn使用方便-不必设计复杂探针n非常灵敏n便宜2、TaqMan探针法TaqMan作用机理TaqMan法优缺点 Real-time PCR 方法应用方法应用n绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究n相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究绝对定量与相对定量的定义绝对定量通过标准品定量n绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：n含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒n含有和待测样品相同扩增片段的cDNAnPCR的产物绝对定量：从荧光到拷贝数相对定量通过内标定量n内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因n在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小n内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量相对定量：参照因子Calibrator 相对定量分析方法1 -Ct前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 CT=表达量的比值相对定量分析方法2：双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度 定量PCR的实验要素样品DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL标准品标准品梯度稀释方法复管测试样品和标准品都要重复重复次数须遵循统计学要求平台PCR仪介绍ABI 7500 fast特征：特征：特征：特征：使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）Rn= Normalization = Reporter / ReferencRotor gene 6500HRM特征：特征：特征：特征：36孔(普通透明0.2mlPCR管)或者72孔(特殊0.1ml管)离心式检测可以做HRM。MJ Opticon 2特征：特征：特征：特征：可以使用8连排管或96孔板，软件操作简单 谢谢！