高高通量测序技术在肿瘤诊断通量测序技术在肿瘤诊断与个体化治疗中的应用与个体化治疗中的应用肿瘤是一种肿瘤是一种基因病基因病基因过表达与基因过表达与突变突变同病异突变同病异突变传统突变检测的传统突变检测的局限性局限性NGSNGS测序的历史高通量高通量测序测序: :一次性对一次性对几百万到十亿条几百万到十亿条DNADNA分分子进行子进行并行测序并行测序，又称为，又称为下一代测序技术下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深深度测序度测序。 High-throughputSequencingNextGenerationSequencingDeepSequencing高通量测序简介（NGS）文库扩增文库扩增低通量低通量Sanger测序测序高通量测序高通量测序并行测序并行测序高通量高通量无需建立文库，无需建立文库，两端加测序接头两端加测序接头PCR扩增扩增ExomeExomesequencingsequencingTranscriptomeTranscriptomesequencingsequencingGenomesequencingGenomesequencingTargetedTargetedsequencingsequencinga:Roche/454,Life/APG,a:Roche/454,Life/APG,PolonatorPolonatorb:b:Illumina/SolexaIllumina/SolexaSolid-PhaseamplificationSolid-Phaseamplificationc:Appliedc:AppliedBiosystemsBiosystems SOLiDSOLiDsystemsystemd:d:HelicosHelicosBiosciences:onepassBiosciences:onepass454 测序流程Illumina Solexa 测序流程ABI SOLiD测序原理平台平台454454SolexaSolexaSOLiDSOLiDPCR磁珠乳化PCR桥式PCR磁珠乳化PCR测序载体磁珠玻片玻片测序方式焦磷酸、荧光可逆终止物、荧光连接酶、荧光结果序列FastQFastQCSFastQ三种平台的技术差异1.对于研究区域比较严格定义的时候，Agilent平台更适合。 2.Illumina平台能够捕获UTR区域，其他平台不行。 3.Agilent能检测到最多的SNP及插入缺失。 科研应用（潜在临床应用前景）外显子组测序外显子组测序Exome Sequencing Allows for Rapid Gene Exome Sequencing Allows for Rapid Gene Identification in aIdentification in a Charcot-Marie-Tooth Charcot-Marie-Tooth FamilyFamily Annual NeurologyAnnual Neurology冰桶挑战冰桶挑战让我们进一步认识了让我们进一步认识了进行性神经性肌进行性神经性肌萎缩综合征萎缩综合征。全外显子测序分析了这一罕见家。全外显子测序分析了这一罕见家系存在的基因突变类型系存在的基因突变类型 （罕见病家系）（罕见病家系）10HBV10HBV（ （+ +） ） HCCwithHCCwithPVTTsPVTTsandandmatchedcontrolsmatchedcontrolsIllumina/Solexasequencing ABISOLiDsequencing Identificationofcandidatesomaticmutations. Identificationofsomaticindels PCR-basedSangerresequencing. 基因组基因组DNA打断打断外显子捕获富集外显子捕获富集文库建立文库建立测序测序原始数据下机原始数据下机数据过滤质控数据过滤质控ShootingGun参考序列无无有有Indel,SNP统计统计氨基酸突变研究氨基酸突变研究GO功能分析功能分析KEGG通路分析通路分析测序深度评估测序深度评估测序覆盖度评估测序覆盖度评估测序随机性评估测序随机性评估分分析析内内容容测测序序评评估估外显子组测序外显子组测序Wei X,Wei X,Walia V,Walia V,et al. et al. ExomeExome sequencing sequencing identifies GRIN2A as frequently mutated identifies GRIN2A as frequently mutated in melanoma. in melanoma. Nat GenetNat Genet黑色素瘤黑色素瘤发生率一直在上升，此研究对黑色素发生率一直在上升，此研究对黑色素瘤细胞进行外显子组捕获测序，发现了和其相瘤细胞进行外显子组捕获测序，发现了和其相关的关的高频突变基因高频突变基因。（某种类型疾病与暴露因某种类型疾病与暴露因素相关性研究）素相关性研究）基因组基因组DNA打断打断外显子捕获富集外显子捕获富集文库建立文库建立测序测序原始数据下机原始数据下机数据过滤质控数据过滤质控ShootingGun参考序列无无有有Indel,SNP统计统计氨基酸突变研究氨基酸突变研究GO功能分析功能分析KEGG通路分析通路分析测序深度评估测序深度评估测序覆盖度评估测序覆盖度评估测序随机性评估测序随机性评估分分析析内内容容测测序序评评估估七个新发现的非同义高频突变位点单个基因中突变位点分析基因基因GRIN2A模式图，箭头表示突变位点模式图，箭头表示突变位点What can/would we do?基于全外显子测序的家族遗传性肿瘤疾病易感性研究（以下以胃癌为例）胃癌（胃癌（GastricCancer）全球：全球：第四大常见癌症；第二大癌症死亡率第四大常见癌症；第二大癌症死亡率平均平均5年存活率年存活率22%，晚期，晚期5年存活率低于年存活率低于5%，男女发病率，男女发病率2:1中国：中国：恶性肿瘤中居首位，西北与东南沿海地区发病率更高恶性肿瘤中居首位，西北与东南沿海地区发病率更高风险：风险：家族遗传、家族遗传、HP、饮食结构、癌前胃部疾病、吸烟等、饮食结构、癌前胃部疾病、吸烟等家族遗传因素：家族遗传因素：胃癌病人亲属的胃癌发病率较普通人高胃癌病人亲属的胃癌发病率较普通人高4倍以上倍以上10%胃癌在家族中遗传胃癌在家族中遗传1%-3%为为CDH1基因突变带来的家族弥漫性胃癌，其他基因突变带来的家族弥漫性胃癌，其他原因目前未知原因目前未知罕见类型或特殊病理类型！罕见类型或特殊病理类型！家族性胃癌是指：家族性胃癌是指：高发病率区高发病率区(如中国如中国)一级和一级和(或或)二级亲属中二级亲属中3例例患病患病其中其中1例是另例是另2例的一级亲例的一级亲属属连续两代发病连续两代发病至少有至少有1例发病年龄例发病年龄50岁。岁。突破点突破点在于：在于：1 1、发现罕见疾病家系、发现罕见疾病家系2 2、收集完整家族血液样本、收集完整家族血液样本3 3、剔除抑制突变、剔除抑制突变、SNPSNP及同义突变及同义突变4 4、发现新的突变、发现新的突变SNPcopy numberSNPcopy number肥胖与HP（+）胃癌的关系研究 胃癌（胃癌（GastricCancer）全球：全球：第四大常见癌症；第二大癌症死亡率第四大常见癌症；第二大癌症死亡率平均平均5年存活率年存活率22%，晚期，晚期5年存活率低于年存活率低于5%，男女发病率，男女发病率2:1中国：中国：恶性肿瘤中居首位，西北与东南沿海地区发病率更高恶性肿瘤中居首位，西北与东南沿海地区发病率更高风险：风险：家族遗传、家族遗传、HP、饮食结构、癌前胃部疾病、吸烟等、饮食结构、癌前胃部疾病、吸烟等家族遗传因素：家族遗传因素：肥胖和肿瘤是全球两大重要的公共卫生问题。肥胖和肿瘤是全球两大重要的公共卫生问题。肥胖可以增加胃癌罹患率肥胖可以增加胃癌罹患率,并且治疗效果差、并且治疗效果差、肿瘤病死率高肿瘤病死率高,但具体机制尚不清楚。但具体机制尚不清楚。肥胖与胃癌均存在一定家族遗传性肥胖与胃癌均存在一定家族遗传性全外显子捕获测序获得初筛数据全外显子捕获测序获得初筛数据Step1Step2Step3先证者先证者母亲母亲父亲父亲DNA/RNAExtractionNext-generationSequencing数据库比对数据库比对SNV、indelanalysis、mutantgenesRT-PCR、IHCoftargetgenesintissuesofproband功能研究功能研究BloodSamplesInvitro/vivostudy5TrioswithHP（+）TissuesTRIOTRIO家庭家庭三口之家三口之家肥胖的定义肥胖的定义1.BMI: 30kg/obesity2.WHR or WHtR（waist-to-hip ratio or waist-to height ratio Male： 0.95obesity Female：0.8obesity三人同时满足！三人同时满足！HP（+）的定义）的定义胃镜胃镜取活检标本检查，取活检标本检查，分离培养分离培养+ +直接涂片检查直接涂片检查+ +病理切片病理切片未经未经任何任何治疗治疗胃癌的定义胃癌的定义胃镜胃镜取活检标本检查，取活检标本检查，病理检测病理检测未经未经任何任何治疗治疗腺癌腺癌( (包括乳头状腺癌、管状腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌包括乳头状腺癌、管状腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌) ) 先证者一人满足！先证者一人满足！C14呼气试验能否确诊呼气试验能否确诊HP（+）？）？实验组实验组对照组对照组3-5TRIOs肥胖家庭肥胖家庭非肥胖家庭非肥胖家庭HPHP（+ +）外显子测序外显子测序普通测序验证普通测序验证DeNovo突变突变体外及动物实验体外及动物实验3-5TRIOsHPHP（+ +）外显子测序外显子测序普通测序验证普通测序验证DeNovo突变突变体外及动物实验体外及动物实验其他标准：其他标准：性别比性别比 TNM TNM 分期分期 先证者年龄先证者年龄质控标本采集：TRIO全血采集（与测序公司讨论所需血样体积），采用抗凝管DNA提取（QIAmp DNA Blood Mini kit）及保存 （1）样品纯度：OD 260/280值应在1.81.82.02.0 之 间；RNA free。 （ 2） 样 品 浓 度 ： 最 低 浓 度 不 低 于 50ng/50ng/l l。 （ 3） 样 品 总 量 ： 每 个 样 品 总 量 不 少 于 1515g g。 （ 4） 样 品 溶 剂 ： 溶 解 在 H20或 TE （ pH 8.0） 中 。 （5）保存：DNA低温运输（-20，干冰）临床应用基于测序的肿瘤个人疾病基于测序的肿瘤个人疾病IDID建立与个体化治疗方案建立与个体化治疗方案癌症突变用药数据库癌症突变用药数据库其他优势其他优势数万份案例临床实验数据库数万份案例临床实验数据库NCCN及及FDA数据库数据库结合人群用药情况（中国）结合人群用药情况（中国）专人监测，实时更新专人监测，实时更新血液样本监测血液样本监测遗传信息监测遗传信息监测二二/三期临床药物推荐三期临床药物推荐私人订制！私人订制！石蜡包埋组织切片或组织块新鲜冰冻组织血液和骨髓其他检测流程CDKVEGF损伤修复基因MDM2反馈调节p21切断肿瘤血供GD-AIFBAI-1TSP血管生成因子抗血管生成因子p53Ku70DNA-PKATM逆转放疗抗性MDR逆转化疗抗性细胞周期阻滞MMP抑制肿瘤浸润转移抑制肿瘤浸润转移NK旁杀伤效应a(II)PH细胞凋亡细胞凋亡促进作用抑制作用肿瘤患者肿瘤患者IDID