酶联免疫吸附试验检测酶联免疫吸附试验检测伤寒伤寒O抗体方法的建立抗体方法的建立李金泽，郑欣宁，杨芳芳，郑思涵李金泽，郑欣宁，杨芳芳，郑思涵2015年年11月月9日日一、何一、何为伤寒寒伤寒是由伤寒杆菌引起的急性肠道传染病。伤寒是一种古老的传染病，但在目前的传染病防治中，仍占有重要的地位。我国的中医学书刊中所称的“伤寒”，指许多热性疾病，在中医学属于“湿温”病范畴，与现代医学的伤寒与副伤寒，具有不同的含义。伤寒是一种全身性的疾病，并非只局限于肠道受损。伤寒的基本病理特征是持续的菌血症与毒血症，单核吞噬细胞系统的增生性反应，以回肠下段淋巴组织为主的增生、肿胀、坏死与溃疡形成等病变为显著。二、二、伤寒的寒的检测伤寒是由伤寒杆菌引起的急性传染病，终年可发病，以夏秋季为多 。对沙门菌进行快速检测，及早发现传染源，切断传播途径，是最有效地防治沙门菌病的手段。一直以来，伤寒的实验室诊断方法主要靠细菌培养和肥达氏反应。前者的阳性率受病人应用抗生素的影响,而后者在病程的后期才出现阳性,且敏感性较低。这两种检测方法繁琐,需要时间较长,难以达到早期、快速诊断目的。为寻求敏感而特异的伤寒杆菌抗体检测法,我们建立了ELISA试验,检测伤寒病人血清中O抗体, 我们采用购买的的伤寒沙门氏菌O抗原免疫家兔，抽取家兔血，经分离与粗纯化，得到粗纯化的伤寒沙门菌O抗体，建立检测伤寒沙门氏菌O抗体的ELISA竞争法,并对伤寒沙门氏菌O抗体进行了检测。三、三、ELISA实验原理实验原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接的放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。竞争法竞争法竞争法(Compering ELISA)可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例， 受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于因相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下：将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体，洗涤、封板；待测管中加受枪标本与一定量酶标抗原的混合溶液，使之与因相抗体反应。如受检标本中无抗 原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。这样，受捡标本中抗原量越高，则由于这些抗原与固相抗体的结合，竞争性的占去了晦标抗原与固相抗体结合的机会，使酶标抗原与固相抗体的结合量越少。参考管中只加酶标抗原。孵育后，酶体抗原与固相抗体的结合可达最充分的量、洗涤。加庇物显色。参考管中由于结合的酶标抗原量最多，故颜色最深。参考音颜色深度与待测管颜色深度之差代表受检标本巾抗原的量。待测管颜色越淡表示标本中抗原量越多。酶联免疫吸附免疫吸附试验检测伤寒寒O抗体抗体材料与方法材料与方法一、一、抗体的制抗体的制备采用颗粒性抗原（伤寒O抗原）免疫家兔。周数周数日期日期操作操作第一周第一天 （2015.9.7）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.1ml第二天 （2015.9.8）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.2ml第三天 （2015.9.9）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.2ml第四天 （2015.9.10）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.5ml第二周第一天 （2015.9.14）两侧背部皮下注射伤寒O菌液各0.5ml第三周第一天 （2015.9.21）耳缘静脉采血至少20ml二、二、抗体抗体的的鉴定定直接凝集试验直接凝集试验3周后由已免疫兔的耳缘静脉采血，37，2500r/min离心30min，取血清。取洁净试管10支，编号，将血清做1:10稀释。混匀后，37孵育24小时，观察结果。管号管号12345678910生理盐水0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5稀释血清0.50.50.50.50.50.50.50.50.50伤寒菌液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5终稀释浓度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120弃三、三、抗体抗体的的分离与分离与纯化化取分离好的免疫血清一份（5ml），加入一份生理盐水（5ml）。 缓慢摇动，加入两份饱和硫酸铵溶液（10ml），室温静置。2000r/min离心20min，吸弃上清。用适量生理盐水（12ml）溶解沉淀，放置于透析袋中，透析24h。收集，标记得到的伤寒沙门氏菌粗抗体，冰冻保存。四、四、酶标抗体的制抗体的制备过碘碘酸酸钠法法取5mg HRP溶于0.5ml PH5.6 HAC-NaAc缓冲液中，滴入NaIO4水溶液，混匀，4作用30min。再加入2.5%乙二醇水溶液，室温放置30min。然后加入待分离纯化的粗抗体，用的碳酸盐缓冲液调整反应液的PH至左右，4过夜。加入NaBH4溶液，混匀，4作用2h，以的PBS溶液溶解沉淀于透析袋中，4过夜。次日收集。五、五、ELISA预实验包被抗原：伤寒抗原用包被液稀释，每孔加入，37作用4h（或4作用24h）。洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤3次，每次30s，于吸水纸上充分拍干。加入样品：每孔加入按倍数稀释好的酶标抗体及待测抗体各，混匀，放入37恒温箱中孵育30min。洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤3次，每次30s，于吸水纸上充分拍干。加入底物液：每孔加入底物液A液1滴，B液1滴，避光放置515min，观察颜色变化。1:11:51:251:1251:251:501:1001:200待测待测 Ab酶标酶标 AbELISA预实验预实验六、六、ELISA正式正式实验包被抗原。弃去ELISA板孔中的包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30s，在滤纸上拍干。将各组原倍的待测血清与工作浓度的酶标抗体，分别加入各孔中，每孔各，同时设定阴性对照，37孵育30min。弃去孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次30s，在滤纸上拍干。加底物显色，每孔加入底物液A液1滴，B液1滴，避光放置515min，观察颜色变化。第一组第一组待测待测Ab第二组第二组待测待测Ab第三组第三组待测待测Ab第四组第四组待测待测Ab阴性阴性对照对照1:100待测待测 Ab酶标酶标 AbELISA正式实验正式实验酶联免疫吸附免疫吸附试验检测伤寒寒O抗体抗体实验结果实验结果一、直接凝集一、直接凝集实验结果果21435678910实验结果肉眼观察在第7管无凝集，直接凝集实验粗略估计伤寒O抗体的效价为1：1280。二、二、酶标抗体的制抗体的制备与与鉴定定用过碘酸钠法制备的酶标抗体经ELISA竞争法鉴定结果：阴阳色差最明显为第三排，即最佳工作浓度为1:100，与第五孔颜色相差最大的味待测抗体原倍浓度。1:251:501:1001:200 1:1 1:5 1:25 1:125 阴性阴性三、三、ELISA竞争法的目争法的目测结果果ELISA竞争法目测实验结果：阴性对照孔出现蓝色；每组均与阴性对照孔有鲜明对比，抗体制备均良好。第二组颜色最浅，抗体效价最高。由于第三组无待测血清，故无第三组结果 1 2 4 对照对照对照对照 4 2 1酶联免疫吸附免疫吸附试验检测伤寒寒O抗体抗体实验讨论及分析实验讨论及分析一、一、ELISA实验过程中注意事程中注意事项实验前半小时从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。选取精确移液管，恒温孵育前振摇过程不可忽略。操作过程应准确无误，实验中稀释液、酶标液、质控物、阴阳性对照和标本的加入量一定要准确，防止阳性对照和未知阳性标本的溅洒造成假阳性结果，以及感染操作人员。孵育温度和时间是夹心抗体（或抗原）形成、竞争结合反应的必要因素，因此要严格控制。一般来说，温度提高而抗原抗体结合的时间可缩短，否则时间延长，所以在试验前要选择最佳温度与时间。洗涤时间洗板时应使洗液注满反应孔，调节洗板次数，保证洗板彻底。洗涤的干净程度直接影响结果。洗板是ELISA 检测的重要环节，应严格按说明书进行，达到洗涤次数和间隔时间要求，从而保证结果的准确度。二、二、 ELISA实验过程中的程中的显色色问题所有检测孔均无色：原因可能为酶结合物或底物失效、底物漏加（错加） 、阳性对照漏加或错加，其中以酶结合物失效和底物错加为常见。查找原因的方法是将酶结合物与底物直接混合，观察有无显色；如显色则提示为阳性对照漏加或底物错加所致；若不显色，用新酶结合物与底物混合，观察有无显色；不显色则提示底物失效，显色提示原用酶结合物失效。所有检测孔均显色：原因多为洗板不净（孔内残留未结合的酶结合物）或显色时间过长。三、三、ELISA法与肥达氏反法与肥达氏反应法法对诊断断伤寒的比寒的比较分析分析肥达氏诊断伤寒为经典血清学检验主要检测血清中抗体，从感染到血中产生抗体要有一定时间，而且操作繁琐，结果慢（过夜观察）。伤寒杆菌抗原酶免ELISA其包被和酶标记抗体均针对伤寒杆菌的单克隆抗体直接检测血清中抗原特异性强、快速、操作简便、从加样到判读实验结果仅需45min。两法通过2检验，具有显著性差异，可作为早期快速辅助诊断伤寒的血清学方法。 近年来由于:抗生素及皮质激素的使用有抑制抗体滴度作用。有些患者感染较轻产生抗体较少。患者体弱免疫反映弱缺乏丙种球蛋白不能产生抗体。少数患者肥达氏凝集效价始终不高，且肥达氏反应阳性反应出现较晚。单凭肥达氏反映诊断伤寒有其局限性，易出现漏诊，因此早期采用单克隆抗体检测血清中抗原帮助临床及早辅助诊断伤寒。四、四、获得高效价的得高效价的伤寒寒O抗体抗体的原因分析的原因分析在抗体的制备过程中，免疫动物的选择，设计有效的免疫程序均可影响制备的抗体质量。实验中采用伤寒沙门菌O抗原，通过耳缘静脉注射和多点背部皮内注射免疫健康家兔，制备伤寒沙门氏菌O抗体。与家兔个体有关，免疫的家兔免疫功能强大，产生抗体量较多。家兔是否每次均被抗原免疫到也是实验成功的关键，获得高效价抗体，也与足量的伤寒沙门氏菌菌体抗原和成功注入有关。抗原直接进入血液被免疫细胞包裹而缓慢地释放，有利于持续地刺激免疫系统。但免疫时要注意抗原浓度和剂量的掌握，避免因抗原浓度太高和抗原剂量太大造成家兔死亡，而太低则不足以刺激机体产生特异的免疫应答。所用的伤寒O抗原纯化度好。五、五、ELISA实验的的应用用在医学研究和临床诊断上，广泛地应用ELISA技术来检测与感染性疾病有关的病原因子及其相应的抗体、体液中的其他抗原成分、激素和药物等。 ELISA酶免疫测定商品试剂检测的项目可分为以下各类。病原体及其抗体的检测。病毒感染如肝炎病毒、巨细胞病毒、风疹病毒、疮疹病毒、 轮状病毒、义滋病病毒(HIV)、非典病毒(SARS)等；细菌感染如链球菌、布氏杆菌等； 寄生虫感染如阿米巴、弓形虫、锥虫等。 蛋白质。各种免疫球蛋白；肿瘤标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺碱性磷酸酶； 激素如HCG、FSH、TSH、hGH；酶如肌酸激酶-MB；其他蛋自质如铁蛋自等。非肽类激素。如T1、T4、雌二醇、皮质醇等。药物。治疗心肌病药物如地谷新、抗哮喘药物如茶碱、抗癫痫药物如苯巴比妥、抗生素如庆大霉素等。ELISA除了在医学检测中的应用外，还在食品检测，水产品检测，植物病毒检测，动物检疫检测，农药残留检测，兽药残留检测，捕食作用研究等多个方面有广泛的应用价值。谢谢！