色 谱（Chromatography)又称色层法或层析法色谱历史色谱历史19031903（19061906）年，）年，Michael Michael TswettTswett提出色谱法提出色谱法19311931年，年，KuhnKuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素采用柱色谱分离了类胡萝卜素19411941年，年，MartinMartin和和SyngeSynge提出分配色谱法提出分配色谱法 19441944年，年，MartinMartin等又提出纸色谱法等又提出纸色谱法 19521952年，年，MartinMartin和和JamesJames发明了气液色谱法发明了气液色谱法19551955年年，第第一一台台商商品品气气相相色色谱谱问问世世，标标志志着着现现代色谱分析的建立代色谱分析的建立19561956年，年，StahlStahl系统研究了薄层色谱法系统研究了薄层色谱法19671967年年，HorvvathHorvvath和和HuberHuber等等研研制制了了高高效效液液相色谱仪相色谱仪19751975年，年，SmallSmall等提出离子色谱等提出离子色谱 2020世纪世纪8080年代，超临界色谱年代，超临界色谱2020世世纪纪9090年年代代，毛毛细细管管电电泳泳（18091809年年ReRessss第一次电泳实验）第一次电泳实验）2121世世纪纪，联联用用技技术术、大大分分子子色色谱谱分分离离、制制备备色谱取得很大的发展色谱取得很大的发展1903年年3月月21日日俄俄国国植植物物学学家家茨茨维维特特（MichaelTswett，1872-1919）在在华华沙沙自自然然科科学学学学会会生生物物学学会会议议上上发发表表了了“一一种种新新型型吸吸附附现现象象及及其其在在生生化化分分析析上上的的应应用用”研研究究论论文文，介介绍绍了了一一种种应应用用吸吸附附原原理理分分离离植植物物色色素素的的新新方方法法，并并首首先先认认识识到到这这种种层层析析现现象象在在分分离离分分析析方方面面有有重重大大价价值值。1906年年他他在在德德国国植植物物学学杂杂志志发发表表文文章章，首首次次命命名名上上述述分分离离后后色色带带为为色色谱谱图图，称称此此方方法法为为色色谱谱法法（Chromatography）。1907年年在在德德国国生生物物学学会会年年会会上上，展展示示过过带带有有色色带带的的分分离离柱柱管管和和纯纯化化过过的的植植物物色色素素溶溶液液。茨茨维维特特被被世世人人公公认认为为色谱创始人。色谱创始人。把菊根粉或白垩粉（把菊根粉或白垩粉（CaCOCaCO3 3）装在玻璃管中，将植物叶子装在玻璃管中，将植物叶子的的石油醚提取液石油醚提取液倒入管中，倒入管中，然后加入然后加入石油醚淋洗石油醚淋洗。随着。随着淋洗进行，样品中各种色素淋洗进行，样品中各种色素向下移动的速度不同，逐渐向下移动的速度不同，逐渐形成一圈圈的连续色带。茨形成一圈圈的连续色带。茨维特在当时的实验中观察到维特在当时的实验中观察到6 6个色带，包括胡萝卜素、叶个色带，包括胡萝卜素、叶黄素和叶绿素黄素和叶绿素A A和和B B。提取液色带ChromatographiccolumnStationaryphaseMobilephaseoreluent茨维特工作的主要贡献茨维特工作的主要贡献（采用吸附色谱）成功分离了叶绿素（采用吸附色谱）成功分离了叶绿素a a和叶绿素和叶绿素b b 提出提出/ /发明了色谱法发明了色谱法19311931年年，KuhnKuhn采采用用柱柱色色谱谱分分离离了了类类胡胡萝萝卜卜素素，进进一一步步确确定定了了-和和-胡胡萝萝卜卜素素的的同同分分异异构构体体，以以及及分分别别从从植植物物叶叶片片和和蛋蛋黄黄中中分分离离得得到到叶叶黄黄素素，才才使使色色谱谱法法引引起起科科学学界界的的重重视视。 KuhnKuhn实实验验不不仅仅证证明明了了蛋蛋黄黄叶叶黄黄素素是是氧氧化化类类胡胡萝萝卜卜素素的的混混合合物物，而而且且证证实实了了色色谱法可以用来进行制备分离。谱法可以用来进行制备分离。 获获得得19521952年年度度的的诺诺贝贝尔尔化化学学奖奖MartinMartin和和SyngeSynge的主要工作的主要工作： 采采用用水水分分饱饱和和的的硅硅胶胶作作固固定定相相，以以含含有有乙乙醇醇的的氯氯仿仿作作流流动动相相，甲甲基基橙橙作作显显色色剂剂（指指示示氨氨基基酸酸的的位位置置）分分离离苯苯丙丙氨氨酸酸、亮亮氨氨酸酸、异异- -亮亮氨氨酸酸和和脯脯氨氨酸酸- -缬缬氨氨酸酸- -蛋氨酸等三组氨基酸。蛋氨酸等三组氨基酸。首首次次提提出出分分离离过过程程的的塔塔板板理理论论，这这是是在在色色谱谱柱柱操操作作参参数数基基础础上上模模拟拟蒸蒸馏馏理理论论，以以理理论论塔塔板板来来表表示分离效率，定量地描述、评价分离过程；示分离效率，定量地描述、评价分离过程； 在在色色谱谱过过程程中中最最早早引引入入分分配配平平衡衡取取代代吸吸附附平平衡衡，即即采采用用分分配配色色谱谱进进行行分分离离。该该方方法法是是针针对对逆逆流流液液- -液液萃萃取取难难题题而而发发明明的的。即即将将一一种种液液体体固固定定在在适适当当的的载载体体上上，使使第第二二种种液液体体流流过过前前者者而而实实现现分分离离，这这也也是是一一个个很重要的成就。很重要的成就。 提提出出了了色色谱谱法法进进一一步步发发展展最最有有远远见见的的预预言言：一是一是“流动相可用气体来代替，对分离更有好处流动相可用气体来代替，对分离更有好处”；二二是是“使使用用非非常常细细颗颗粒粒的的填填料料和和柱柱两两端端施施加加较较大大的的压压差，应能得到最小的理论塔板差，应能得到最小的理论塔板”。ArcherJohnPorterMartinRichardLaurenceMillingtonSyngefortheirinventionofpartitionchromatography19521952年年，MartinMartin和和JamesJames发发表表第第一一篇篇气气液液色色谱谱论论文文，首首次次用用气气体体作作流流动动相相，配配合合微微量量酸酸碱碱滴滴定定，发发明明了了气气相相色色谱谱，它它给给挥挥发发性性化化合合物物的的分分离离测测定定带带来来了了划划时时代代的的革革命命。Van Van DeeterDeeter、GiddingsGiddings等人对色谱理论的研究极大地促使色谱技术的发展。等人对色谱理论的研究极大地促使色谱技术的发展。 19551955年年，第第一一台台商商品品气气相相色色谱谱问问世世，标标志志着着现现代代色色谱谱分分析析的的建立。建立。 19571957年年, ,戈雷戈雷( (GolayGolay) )发表发表“涂壁毛细管气液分配色谱理论和涂壁毛细管气液分配色谱理论和实践实践”论文，首先提出毛细管速率方程，并第一次实现了毛细论文，首先提出毛细管速率方程，并第一次实现了毛细管气相色谱分离。管气相色谱分离。 19791979年年, ,弹性石英毛细管应用于气相色谱弹性石英毛细管应用于气相色谱, , 将毛细管气相色谱将毛细管气相色谱推上高潮。推上高潮。8080年代将固定液固载化是毛细管色谱技术的又一个年代将固定液固载化是毛细管色谱技术的又一个重要发展。它大大提高了色谱柱的稳定性重要发展。它大大提高了色谱柱的稳定性, , 延长了柱寿命延长了柱寿命, , 并并使液膜进一步增厚使液膜进一步增厚, , 提高了色谱性能提高了色谱性能 ( (如可在高温下使用如可在高温下使用) )。 Horvvath(1967)Horvvath(1967)、Huber(1967)Huber(1967)、Kirkland(1969)Kirkland(1969)分分别别研研制制高高效效液液相相色色谱谱仪仪，他他们们的的主主要要贡贡献献主主要要是是技技术术上上的突破：的突破： 高效填料高效填料：细颗粒、耐压；特别是键合固定相：细颗粒、耐压；特别是键合固定相 高高压压泵泵: :克克服服细细填填料料带带来来的的流流速速慢慢的的缺缺点点，加加快快了了传质过程传质过程 仪器检测仪器检测：高灵敏度连续检测：高灵敏度连续检测 高高效效液液相相色色谱谱的的重重要要特特征征是是由由“开开放放柱柱液液相相色色谱谱”向向“密闭柱密闭柱液相色谱液相色谱”方向发展。方向发展。 19751975年，年，Small, Stevens Small, Stevens 和和BaumenBaumen发表发表“Novel Ion Novel Ion Exchange Chromatographic Method Using Exchange Chromatographic Method Using ConductimetricConductimetric Detection” Detection” 一文，采用离子抑制柱一文，采用离子抑制柱- -电导检测器检测，标志着电导检测器检测，标志着离子色谱法离子色谱法的诞生。的诞生。色谱与色谱分析色谱与色谱分析色色谱谱法法是是一一种种分分离离方方法法，它它利利用用物物质质在在两两相相中中分分配配系系数数的的微微小小差差异异，当当两两相相作作相相对对移移动动时时，使使被被测测物物质质在在两两相相之之间间进进行行反反复复多多次次分分配配，这这样样原原来来微微小小的的分分配配差差异异产产生生了了很很大大的的效效果果，使使各各组组分分分分离离，以以达达到到分分离离、分分析析及及测测定定一些物理化学常数的目的。一些物理化学常数的目的。分离性质差异：在两相间的分配差异分离性质差异：在两相间的分配差异多次反复分配：分离效果被扩大多次反复分配：分离效果被扩大 分分配配系系数数是是广广义义的的，包包括括溶溶解解、吸吸附附、离离子交换、亲和力和分子体积等分离特性。子交换、亲和力和分子体积等分离特性。物物质质能能否否分分离离取取决决于于它它们们之之间间是是否否存存在在分分配配差差异异，这这是是一一切切分分离离的的必必要要条条件件，色色谱谱也也不不能能例外。例外。与与其其它它分分离离法法相相比比，色色谱谱法法的的高高效效率率在在于于独独特特的的“动动态态分分离离过过程程” ” ，即即反反复复多多次次分分配配，它它大大大大扩扩大大了了原原来来分分配配系系数数的的差差异异，从从而而实实现现混合物的分离。混合物的分离。 由由于于色色谱谱（包包括括电电泳泳）分分离离的的宏宏观观特特征征之之一一是是“差差速速迁迁移移” ” ，即即样样品品同同时时进进入入色色谱谱柱柱或或在在同一起始位置，经过同一起始位置，经过“一定时空一定时空”的分离：的分离： 内内色色谱谱：固固定定分分离离时时间间，各各组组分分处处在在色色谱谱或或电泳分离通道上不同位置（如电泳分离通道上不同位置（如TLCTLC的斑点位置）。的斑点位置）。 外外色色谱谱：固固定定分分离离路路程程，各各组组分分以以不不同同时时间间流出色谱柱或到达检测器（色谱图）。流出色谱柱或到达检测器（色谱图）。 距离和时间的测定是简便的和准确的距离和时间的测定是简便的和准确的。 色色谱谱分分析析法法是是一一种种十十分分重重要要和和应应用用广广泛泛的的仪仪器器分分析析方方法法。它它采采用用色色谱谱分分离离和和连连续续测测定定方方式式相相结结合合方方式式，实实现现了了对对复复杂杂体体系系中中的的多多组组分分（包包括括价价态态、性性质质相相近近的的元元素素或或化化合合物物）分分析析。可可见见，色色谱谱分分析析的的关关键键是是实实现现分分离离分分析析系系统化统化/ /一体化。一体化。 现代色谱分析现代色谱分析包括GC、HPLC、SFC、HPTLC、CE及联用技术。色谱常用术语色谱常用术语 1 1固定相固定相 固固定定相相是是由由层层析析基基质质组组成成的的。其其基基质质包包括括固固体体物物质质( (如如吸吸附附剂剂、离离子子交交换换剂剂) )和和液液体体物物质质( (如如固固定定在在纤纤维维素素或或硅硅胶胶上上的的溶溶液液) )，这这些些物物质质能能与与相相关关的的化化合合物物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。 2 2流动相流动相 在在层层析析过过程程中中推推动动固固定定相相上上的的物物质质向向一一定定方方向向移移动动的的液液体体或或气气体体称称为为流流动动相相。在在柱柱层层析析时时，流流动动相相又又称称洗洗脱脱剂剂或或洗洗涤涤剂剂( (即即推推动动有有效效成成分分或或杂杂质质向向一一定定方方向移动的溶液向移动的溶液) )。在薄层层析时流动相又称展层剂。在薄层层析时流动相又称展层剂。3. 3. 色谱色谱 以以基基质质为为固固定定相相( (柱柱状状或或薄薄层层状状) )，以以液液体体或或气气体体为为流流动动相相，有有效效成成分分和和杂杂质质在在这这两两个个相相中中连连续续多多次次地地进进行行分分配配、吸吸附附或或交交换换作作用，最终结果是使混合物得到分离。用，最终结果是使混合物得到分离。 4. 4. 操作容量操作容量 即在特定条件下，某种成分与基质反应即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。 一般以每克一般以每克( (或毫升或毫升) )基质结合某种成分基质结合某种成分的摩尔数或毫克数来表示。其数值大，表明的摩尔数或毫克数来表示。其数值大，表明基质对某种成分的结合力强。否则反之。基质对某种成分的结合力强。否则反之。 5 5床体积床体积( (VtVt) ) 通通常常床床体体积积是是指指膨膨胀胀后后的的基基质质在在层层析析柱中所占有的体积柱中所占有的体积( (VtVt) )。 VtVt是是基基质质的的外外水水体体积积(Vo)(Vo)和和内内水水体体积积(Vi)(Vi)以及自身体积以及自身体积(Vg)(Vg)的总和。即的总和。即 VtVtVoVo十十ViVi十十VgVg 6 6洗脱体积洗脱体积( (VeVe) ) 洗洗脱脱体体积积是是指指某某一一成成分分从从柱柱顶顶部部到到底底部部的的洗洗脱脱液液中中出出现现浓浓度度达达到到最最大大值值时时的的流流动相体积。动相体积。 7 7外水体积外水体积(Vo)(Vo) 外水体积指基质颗粒之间体积的总和。外水体积指基质颗粒之间体积的总和。 8 8内水体积内水体积(Vi)(Vi) 内水体积是指基质颗粒内部体积。内水体积是指基质颗粒内部体积。 9. 9. 基质体积基质体积(Vg)(Vg) 基基质质体体积积是是指指基基质质自自身身所所具具有有的的体体积积。VoVo、ViVi、VgVg都都是是随随着着床床体体积积和和基基质质性性质质变变化而变化的。化而变化的。图图层层析析床床的的外外水水体体积积(Vo)、内内水水体体积积(Vi)、总体积总体积(Vt)示意图示意图1010分配系数和迁移率分配系数和迁移率 分分配配系系数数是是指指一一组组分分在在固固定定相相与与流流动动相相中中含量的比值。常用含量的比值。常用K K表示。表示。 迁迁移移率率是是指指一一组组分分在在相相同同时时间间内内，在在固固定定相相移移动动的的距距离离与与流流动动相相移移动动距距离离之之比比值值，常常用用RfRf表示。表示。 K K值值大大，就就表表明明该该组组分分对对固固定定相相结结合合力力大大，迁迁移移率率小小。反反之之则则结结合合力力小小，迁迁移移率率大大。不不同同物质的分配系数和迁移率是不一样的。物质的分配系数和迁移率是不一样的。 几几种种物物质质之之间间的的分分配配系系数数或或迁迁移移率率的的差差异异程程度度是是决决定定它它们们采采用用层层析析方方法法能能否否分分离离开开的的先先决条件。其差异程度越大分离效果就越好。决条件。其差异程度越大分离效果就越好。色谱设备色谱设备色谱柱梯度混合器恒流泵部分收集器检测仪记录仪色谱柱色谱柱梯度混合器梯度混合器图溶液梯度的形成图溶液梯度的形成盐盐浓浓度度盐盐浓浓度度盐盐浓浓度度流出液体积流出液体积流出液体积流出液体积流出液体积流出液体积型型型恒流泵恒流泵自动部分收集器自动部分收集器紫外检测仪紫外检测仪记录仪记录仪AKTApurifier101.色谱柱2.吸附剂及用量3.装柱4.上样和洗脱5.收集和检测6.吸附剂的再生色谱操作色谱操作图理想的装柱示意图4.上样和洗脱图加样操作示意图5.收集和检测6.吸附剂的再生色谱分类色谱分类按两相所处状态分：按两相所处状态分：流动相流动相液体液体气体气体固固定定相相液液体体液液色谱液液色谱气液色谱气液色谱固固体体液固色谱液固色谱气固色谱气固色谱吸附吸附固体固体 吸附能力不同吸附能力不同分配分配液体液体 分配系数不同分配系数不同离子交换离子交换 离子交换剂离子交换剂 亲和性不同亲和性不同凝胶凝胶多孔凝胶，多孔凝胶， 通过速度不同通过速度不同亲和亲和固定相只能与一种组分结合，固定相只能与一种组分结合，分开其它无亲和力的组分分开其它无亲和力的组分按色谱原理分：按色谱原理分： 固定相固定相 各组分对固定相各组分对固定相柱柱固定相装于柱内固定相装于柱内纸纸固定相是液体，吸附在滤纸上，将样品固定相是液体，吸附在滤纸上，将样品点在纸上，用流动相展开点在纸上，用流动相展开薄层薄层将有将有适当粘度的固定相涂在薄板上适当粘度的固定相涂在薄板上薄膜薄膜与纸层析相似，与纸层析相似，纸用其它高分子有机吸附剂代替纸用其它高分子有机吸附剂代替按操作形式分：按操作形式分： 按色谱动力学过程分类按色谱动力学过程分类 迎头法、顶替法和洗脱法迎头法、顶替法和洗脱法 按应用目的分类按应用目的分类 分析型色谱和制备型色谱分析型色谱和制备型色谱 按按色色谱谱过过程程的的特特殊殊物物理理化化学学原原理理或或特特殊殊的的操作方式操作方式分类，如：分类，如： * * 化学键合相色谱化学键合相色谱 * * 裂解色谱裂解色谱 * * 二维色谱二维色谱 * * 手性色谱手性色谱其他分类方式其他分类方式色谱图与色谱参数色谱图与色谱参数 色谱图色谱图（色谱流出曲线色谱流出曲线）是柱后流出物通过检测器产生的响应信号对时间响应信号对时间或流动相流出体积的关系曲线图。它反映分离的各组分从色谱柱洗出浓度随时间的变化，从一个侧面记录组分在柱内运行的情况。 分离过程研究或分离制备，关注被分离物在柱上的位置；“谱带，Band” 分析测定关注分离信号；“色谱峰，Peak”色谱峰的个数、位置、大小和形状？l l色谱峰个数：色谱峰个数：与样品组分数有关与样品组分数有关l色谱峰大小：色谱峰大小：“定量定量” 峰高和峰面积峰高和峰面积l色色谱谱峰峰形形状状：“高高斯斯峰峰” ，峰峰宽宽 “柱柱效效”：标准偏差：标准偏差 、半峰高宽度、峰（底）宽、半峰高宽度、峰（底）宽 W W0.607h0.607h = 2 = 2 W Wh/2h/2 = 2.354 = 2.354 W = 4 W = 4 l色色谱谱峰峰位位置置：“定定性性” 保保留留时时间间或或保保留留体体积；死时间或死体积；计算容量因子等参数积；死时间或死体积；计算容量因子等参数 保保留留值值定定性性的的依依据据：两两个个相相同同的的物物质质在在相相同同的的色色谱谱条条件件下下应应该该有有相相同同的的保保留留值值。但但相相反反的的结结论论不不一一定定成成立立，即即在在相相同同的的色色谱谱条条件件下下，具具有有相相同同的的保保留留值值的的两两个个物物质质不不一一定定是是同同一一物物质质。这这就就使使得得使用保留值定性时必须十分慎重。使用保留值定性时必须十分慎重。实实验验方方法法：在在相相同同的的色色谱谱条条件件( (色色谱谱柱柱、流流动动相相组组成成、柱柱温温、流流速速等等不不变变) )下下分分别别测测定定被被测测化化合合物物与与标标准准样样的的保保留留值值，如如果果保保留留值值相相等等, , 就就可可初初步步认认为为被被测测化化合物为标准样化合物。合物为标准样化合物。 利利用用保保留留值值定定性性方方法法简简便便, , 除除了了要要求求提提供供标标准准化化合合物物（对对照照品品）、控控制制相相同同色色谱谱条条件件外外，更更重重要要的的是是要要对对样样品品组组分分要要有有足足够够的的了了解解, , 同同时时相相关关组组分分的的分分辨辨率要足够高率要足够高。 由由于于某某些些组组分分的的保保留留值值可可能能相相同同或或非非常常接接近近, , 可可采采用用不不同同( (特特别别是是性性质质相相差差较较大大) )的的色色谱谱体体系系, , 如如多多次次改改变变流流动动相相组组成成后后, , 若若被被测测化化合合物物的的保保留留值值与与标标准准物物的的保保留留值值均保持一致均保持一致, , 则能进一步证明被测化合物与标准物一致。则能进一步证明被测化合物与标准物一致。 其他色谱定性方法其他色谱定性方法 。如何提高保留值定性方法的可靠性？如何提高保留值定性方法的可靠性？色谱峰形状与峰宽色谱峰形状与峰宽 在在等等温温线线性性的的色色谱谱条条件件下下，色色谱谱峰峰一一般般呈呈对对称称的的正正态态分分布布（高高斯斯，GaussianGaussian）曲曲线线。 色色谱谱流流出出曲曲线方程为：线方程为：3a3a）为什么大多数色谱图不是对称的高斯峰？为什么大多数色谱图不是对称的高斯峰？3b3b）增大进样量，色谱峰增大，半高峰宽会变增大进样量，色谱峰增大，半高峰宽会变大吗？为什么？大吗？为什么？3c3c）峰宽与柱效的关系峰宽与柱效的关系色谱峰的区域宽度与组分的保留时间一般呈线性色谱峰的区域宽度与组分的保留时间一般呈线性关系，即峰半高宽度或峰低宽度随组分保留时间呈关系，即峰半高宽度或峰低宽度随组分保留时间呈线性增加。线性增加。 影响色谱峰大小的因素影响色谱峰大小的因素a a）峰高可以定量吗？为什么？峰高可以定量吗？为什么？b) b) 对于同一样品中的对于同一样品中的A A和和B B两个组分，能否直接用两个组分，能否直接用峰大小判断它们的含量大小？峰大小判断它们的含量大小？ 进样量进样量: : m = CVm = CV 检测器灵敏度，如波长选择、灯能量检测器灵敏度，如波长选择、灯能量 流速流速 记录仪参数（纸速、灵敏度）记录仪参数（纸速、灵敏度）（1 1）色谱定量分析的基本公式色谱定量分析的基本公式 与其他仪器分析一样，色谱定量分析是一种相对与其他仪器分析一样，色谱定量分析是一种相对定量方法。任何色谱分析的定量基础是：定量方法。任何色谱分析的定量基础是： A Ai i = f = fi iC Ci0i0V V0 0 或或 h hi i = f= fi iC Ci0i0V V0 0 建立定量分析方法都必须验证建立定量分析方法都必须验证A A（h h） m m（C C）的的线性范围。线性范围。（2 2）定量校正因子的测定定量校正因子的测定l l同一种物质在不同类型检测器上有不同的响应灵敏同一种物质在不同类型检测器上有不同的响应灵敏度度l l同一种检测器对不同类型物质有不同的响应值同一种检测器对不同类型物质有不同的响应值 色色谱谱图图是是色色谱谱分分析析的的主主要要技技术术资资料料。色色谱谱图图除除了了样样品品（化化合合物物）名名称称，还还应应注注明明色色谱谱柱柱（固固定定相相）、流流动动相相（载载气气）、操操作作条条件件（柱柱温温等等）、检检测测器器的的类类型型和和操操作作参参数数，样样品品类类型型及有关说明等。及有关说明等。色谱图提供的分析信息色谱图提供的分析信息l直观分离情况 l混合试样中的最低组分数 l柱效l定性l定量色谱应用与局限色谱应用与局限 色谱法与经典化学分析的比较色谱法与经典化学分析的比较 色谱法与光谱、质谱分析法的比较色谱法与光谱、质谱分析法的比较 色谱分析的特点色谱分析的特点 色谱分析的局限性：色谱分析的局限性： 定性能力？（未知样品）定性能力？（未知样品） 色谱数据的色谱数据的“漂移漂移”？ （对比光谱数据）（对比光谱数据） 色谱法与经典化学分析的比较色谱法与经典化学分析的比较 化学分析根据物质具有某种独特的化学性质来进行测定, 而色谱分析能使许多化学性质相同/相似的复杂组分相互分离后测定。 色谱法与光谱、质谱分析法色谱法与光谱、质谱分析法* *的比较的比较 光谱、质谱主要是定性分析工具, 色谱是分离分析的工具。色谱法的最大优越性在于它最擅长分离分析多组分的复杂体系。* *从从分分离离科科学学角角度度分分析析，色色谱谱法法、电电泳泳法法和和质质谱法有哪些异同点？谱法有哪些异同点？ 色谱法与分馏法的比较色谱法与分馏法的比较 色谱分离比分馏快，得到的物质纯度比分色谱分离比分馏快，得到的物质纯度比分离法高。石油化学家采用分馏法花了离法高。石油化学家采用分馏法花了2020多年多年才鉴别出石油中的才鉴别出石油中的200200余种组分，而当今采用余种组分，而当今采用毛细管毛细管GCGC仅需数小时即可完成。仅需数小时即可完成。苯和苯和环己烷的环己烷的bpbp仅差仅差0.60.6，如用分离柱进行分离是，如用分离柱进行分离是不可能的。不可能的。（？）（？）051015202530tR/sec苯环己烷图图 苯和环己烷气相色谱图苯和环己烷气相色谱图5050cm0.5cm(id)cm0.5cm(id)，5%5%丁二酸丁二酸乙二醇聚酯乙二醇聚酯/ /CeliteCelite载体载体（100-120100-120目），柱温目），柱温9090色谱分析的特点色谱分析的特点(1)高选择性高选择性 对于那些性质极为相似的组分, 如同位素、同分异构体, 采用高选择性固定相，使它们之间的分配系数产生足够大的差异, 从而实现良好分离。（色谱的热力学性质） (2)高柱效高柱效 在良好的操作条件下，色谱柱能使复杂或相似的多组分样品, 在两相间进行多次的分配(103-106)而实现分离。(3)高高灵灵敏敏度度：多种高灵敏检测器，痕量杂质分析的有力工具。(4)分分析析速速度度快快：复杂多组分样品分析仅几-几十分钟(5)定定量量准准确确：分离检测一体化，仪器实现自动化、微机化，保证分析结果的准确性。 (6)应用范围广应用范围广(7)试样用量少试样用量少 色色谱谱分分析析的的应应用用面面广广, , 但但它它不不是是万万能能的的。这这要要求求色色谱谱分分析析者者必必须须根根据据分分析析对对象象和和要要求求选选择择色色谱谱方方法法( (色谱系统、检测器等色谱系统、检测器等) )。（2 2）试试液液是是否否处处理理得得当当，是是色色谱谱分分析析又又一一个个关关键键因因素素。试试液液含含有有不不溶溶物物、强强酸酸或或强强碱碱性性等等存存在在，不不仅仅可可能影响分析结果，而且损坏仪器部件。能影响分析结果，而且损坏仪器部件。 学习色谱分析时，应注意如下几个问题学习色谱分析时，应注意如下几个问题：（1 1）色色谱谱仪仪并并不不是是色色谱谱柱柱和和检检测测器器的的简简单单堆堆积积，柱柱外外效效应应是是决决定定峰峰展展宽宽的的另另一一重重要要因因素素，是是决决定定整整个个色谱系统连接的合理性的依据。色谱系统连接的合理性的依据。（3 3）现现有有色色谱谱资资料料大大多多讨讨论论分分子子量量低低于于20002000的的小小分分子子化化合合物物的的分分析析。特特殊殊的的分分离离问问题题，如如球球烯烯化化合合物物、生生物物大大分分子子等等分分离离不不能能简简单单地地套套用用小小分分子子化化合合物物的的色谱方法。色谱方法。（4 4）为为了了达达到到选选择择良良好好的的分分析析条条件件, , 取取得得良良好好数数据据, , 要要求求色色谱谱工工作作者者应应完完全全了了解解色色谱谱法法理理论论, , 从从逻逻辑辑上上探探讨讨错错误误的的原原因因( (或或理理性性分分析析谱谱图图), ), 并并不不断断地地积积累累有关的经验。有关的经验。色谱分析的局限性色谱分析的局限性 对分析对象的鉴定功能较差对分析对象的鉴定功能较差 单次分析周期可能较长单次分析周期可能较长？ 浓度检测灵敏度可能较低浓度检测灵敏度可能较低？ 仪器及费用也许较贵仪器及费用也许较贵 实验影响因素较多，需要有较高的专实验影响因素较多，需要有较高的专业知识业知识第三章第三章吸附层析吸附层析(absorptionchromatography)第一节吸附柱层析吸吸附附柱柱层层析析是是以以固固体体吸吸附附剂剂为为固固定定相相，以以有有机机溶溶剂剂或或缓缓冲冲液液为为流流动动相相构构成成柱柱状状的的一一种种层层析方法。析方法。常用的吸附剂：常用的吸附剂： 极性极性 羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等 非极性非极性 活性炭等。活性炭等。一、基本原理一、基本原理 吸吸附附剂剂的的表表面面存存在在着着许许多多随随机机分分布布的的吸吸附附位位点点。这这些些位位点点通通过过范范德德华华力力和和静静电电引引力力与与蛋蛋白白质质和和核核酸酸等等生生物物分分子子结结合合，其其结结合合力力的的大大小小与与各各种种生生物物分分子子的的结结构构和吸附剂的性质有密切关系。和吸附剂的性质有密切关系。图吸附柱层析原理示意图1.吸附层析柱2.加入A、B混合样品3.洗脱时，A与B开始分离4.继续洗脱时，A与B已经分离二、吸附剂1吸附剂的选择吸附剂应具备性能：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等。2.吸附剂的性质羟基磷灰石(HA)硅胶三、洗脱剂合适的洗脱剂应符合下列条件：纯度较高稳定性好能较完全洗脱下所分离的成分粘度小易和所需要的成分分开。1.纯化生命物质四、应用图天然的双链(ds)和热变性单链(ss)小牛胸腺DNA在HTP层析柱的分离图谱2.分离蛋白质的亚基一般蛋白质经SDS或TritonX100等去污剂处理后，会产生分子量不同的蛋白质亚基。这些物质可通过吸附柱层析方法得到分离(见图)。图14C-组氨酸标记的免球蛋白亚基在HA层析柱的分离图谱第二节薄层层析Thinlayerchromatography,TLC薄层层析(thinlayerchromatography,TLC)是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。其基本原理和柱层祈、纸层折比较相近。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。分类吸附薄层层析(吸附剂为固定相)分配薄层层析(固定在支持剂上的水溶液或有机溶剂为固定相)离子交换薄层层析(离子交换剂为固定相)等表薄层层析常用的基质与纸层析比薄层层析多一步薄层板的制作：与纸层析比薄层层析多一步薄层板的制作：与纸层析比薄层层析多一步薄层板的制作：与纸层析比薄层层析多一步薄层板的制作： 将支持剂均匀地涂布在玻璃板上而成薄层板。所将支持剂均匀地涂布在玻璃板上而成薄层板。所将支持剂均匀地涂布在玻璃板上而成薄层板。所将支持剂均匀地涂布在玻璃板上而成薄层板。所用玻璃板要求表面平整、光滑，用前应洗净、干燥。用玻璃板要求表面平整、光滑，用前应洗净、干燥。用玻璃板要求表面平整、光滑，用前应洗净、干燥。用玻璃板要求表面平整、光滑，用前应洗净、干燥。 薄层板常用的制作方法有：薄层板常用的制作方法有：薄层板常用的制作方法有：薄层板常用的制作方法有： 1 1 1 1、浸涂法：、浸涂法：、浸涂法：、浸涂法： 将玻璃板在调好的支持剂浆液中浸一下，使浆液将玻璃板在调好的支持剂浆液中浸一下，使浆液将玻璃板在调好的支持剂浆液中浸一下，使浆液将玻璃板在调好的支持剂浆液中浸一下，使浆液在玻璃板上形成薄层。在玻璃板上形成薄层。在玻璃板上形成薄层。在玻璃板上形成薄层。 2 2 2 2、喷涂法：、喷涂法：、喷涂法：、喷涂法： 用喷雾器将调好的浆液喷在玻璃板上，形成薄层。用喷雾器将调好的浆液喷在玻璃板上，形成薄层。用喷雾器将调好的浆液喷在玻璃板上，形成薄层。用喷雾器将调好的浆液喷在玻璃板上，形成薄层。 3 3 3 3、倾斜涂布法（倾淌法）、倾斜涂布法（倾淌法）、倾斜涂布法（倾淌法）、倾斜涂布法（倾淌法）： 将调好的支持剂浆液倒在玻璃板上，然后将玻璃板将调好的支持剂浆液倒在玻璃板上，然后将玻璃板将调好的支持剂浆液倒在玻璃板上，然后将玻璃板将调好的支持剂浆液倒在玻璃板上，然后将玻璃板前后左右倾斜，使支持剂漫布于整块玻璃板上而形成前后左右倾斜，使支持剂漫布于整块玻璃板上而形成前后左右倾斜，使支持剂漫布于整块玻璃板上而形成前后左右倾斜，使支持剂漫布于整块玻璃板上而形成薄层。薄层。薄层。薄层。 4 4、推铺法：、推铺法： 在一根玻璃棒的两端适当距离处分别绕几在一根玻璃棒的两端适当距离处分别绕几圈胶布条，胶布条的圈数视所需薄层层析厚度圈胶布条，胶布条的圈数视所需薄层层析厚度而定，然后把准备好的支持剂倒在玻璃板上的而定，然后把准备好的支持剂倒在玻璃板上的一端，用玻璃棒压在玻璃板上，将支持剂均匀一端，用玻璃棒压在玻璃板上，将支持剂均匀地向另一个方向推动，而成为一薄层。地向另一个方向推动，而成为一薄层。 薄层层析的其它操作方法与纸层析薄层层析的其它操作方法与纸层析类似：点样、展开、显色、定性与类似：点样、展开、显色、定性与定量分析。定量分析。