LOGO柴胡龙牡汤柴胡龙牡汤对对小鼠小鼠LewisLewis肺癌细胞肺癌细胞凋亡的影响及其机制的实验研究凋亡的影响及其机制的实验研究辽宁中医药大学附属医院辽宁中医药大学附属医院 肿瘤科肿瘤科 潘玉真潘玉真 研 究 背 景 临床运用柴胡龙牡汤治疗存在咳嗽、咳痰等肺 经症状的肺癌患者 43例，显效 5例（12%），有效 31例（72%），无效 7例（16%），总有效率（显效有效）达 84% 1 。 体内实验研究已证实，该药具有抑制 Lewis 肺癌细胞生长的作用，对荷瘤小鼠的抑瘤率可达 31.4% 2 。1调整气机治疗肺癌肺经症状43例临床研究. 秦海运，殷东风;实用中医内科杂志, 2009,23(4)80-82 .2肺积宁方对C57小鼠肺癌VEGF蛋白表达和生存质量的影响现代肿瘤医学，2009, 17（6）：1042-1045.柴胡龙牡汤前期研究www.themegallery.com中药与细胞凋亡的研究肿瘤的发生不仅因细胞过度增殖，还与细胞凋亡机制受到抑制不能正常进行细胞死亡清除有关细胞凋亡过程多因素、多基因联合作用结果。中药复方成分更为复杂，其作用多环节、影响细胞凋亡方面可能更为有效辽宁中医药大学附属医院中药与细胞凋亡细胞凋亡与肿瘤研 究 背 景www.themegallery.com 实 验 动 物C57BL/6J 近交系小鼠，共 60 只，4 - 6 周龄，清洁级，体重 18-20 g，雌雄各半。中国医学科学院医学实验动物研究所提供，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心。辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院实 验 材 料www.themegallery.com瘤 株Lewis 肺癌瘤株 ( Lewis Lung carcinoma LLC ) ，为小鼠来源的上皮样肺腺癌细胞。由中国医科大学免疫教研室提供。辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院实 验 材 料www.themegallery.com柴胡龙牡汤药物组成：由柴胡、龙骨、牡蛎、黄芩、半夏、太子参、桔梗、炙甘草等11味中药组成。药物煎煮方法：先后用 10 倍水煎 60 min 、8倍水煎煮 40 min ，合并煎煮液，过滤后，浓缩至 1.0 g 生药生药 / ml，置于 4 冰箱保存备用。辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院实 验 药 品www.themegallery.com顺 铂顺铂(DDP)：齐鲁制药有限公司产品, 制剂规格为10 mg / ml 。每次给药前用 0.9% 生理盐水，把10mg 顺铂稀释成1mg / ml 顺铂注射液备用。辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院实 验 药 品www.themegallery.com动 物 造 模细胞株的复苏及C57BL/6J 小鼠体内传代 注入小鼠腹腔中，注入小鼠腹腔中，每只小鼠注射每只小鼠注射0.2ml0.2ml。加入加入2ml2ml生理盐水生理盐水吹打混匀吹打混匀离心两次离心两次每次每次5min5min3737水浴箱水浴箱-8080冰箱冰箱辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院www.themegallery.com动 物 造 模模型制备辽宁中医药大学镜下调整细胞浓度镜下调整细胞浓度为为1 110107 7/ml/ml无菌抽取无菌抽取小鼠腹腔积液小鼠腹腔积液腹部隆起腹部隆起明显的小鼠明显的小鼠0.2ml/只只，接种于，接种于小鼠右侧腋部皮下小鼠右侧腋部皮下 辽宁中医药大附属医院www.themegallery.com动 物 分 组-模型组中药组化疗组综合组正常组肺癌模型组接种肺癌瘤株，不做治疗处理。中药柴胡龙牡汤组接种肺癌瘤株，并中药治疗。单纯顺铂化疗组接种肺癌瘤株，并化疗。柴胡龙牡汤顺铂综合组接种肺癌瘤株，中药联合化疗处理。正常对照组不做造模及治疗处理。共分 5 组辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院www.themegallery.com实 验 给 药 辽宁中医药大学化疗组顺铂注射液0.1ml /只只/ d （DDP 0.1mg） 腹腔注射化疗，共3 次，于第1、3、5天给药。 同时生理盐水0.4ml/只只/d灌胃，共12天中药组柴胡龙牡汤0.4ml /只只/ d （含生药0.4g） 灌胃，共连续12天。 第1、3、5天，生理盐水0.1ml /只只/ d ，腹腔注射。辽宁中医药大学附属医院www.themegallery.com实 验 给 药 辽宁中医药大学综合组顺铂注射液给药剂量、方法同化疗组，柴胡龙牡汤用法同中药组 。模型组正常组0.9%生理盐水0.4ml /只只/ d 灌胃，共连续12天。 并于第1、3、5天， 0.9%生理盐水0.1ml /只只/ d ，腹腔注射。辽宁中医药大学附属医院www.themegallery.com实 验 取 材 各组小鼠均于末次给药后24小时进行取材完整剥离出瘤体，称重后于冰盒上，将瘤块切开在无坏死区共取材 3 份，标本块大小约为1 mm3 。 辽宁中医药大学Text蛋白测定 电镜检测 免疫组化检测 立即置于-20冰箱中冻存备用。 于戊二醛固定液中，4冷藏备用。 置于甲醛固定液中备用。 辽宁中医药大学附属医院www.themegallery.com统 计 分 析统计学分析采用SPSS11.0软件包。计量资料 进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），），组间比较采用最小显著差法（LSD）方法。等级资料 采用非参数统计方法-秩和检验辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院实 验 指 标透射电镜下观察肿瘤组织超微结构变化检测肿瘤组织中 TNF 的蛋白表达，采用免疫组织化学法凋亡相关基因 Bax、 Bcl-2、Caspase3蛋白表达，用 Western blot方法探讨柴胡龙牡汤诱导Lewis肺癌细胞凋亡的分子作用机制 辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院肿瘤细胞透射电镜观察呈现出恶性肿瘤细胞呈现出恶性肿瘤细胞特征。细胞核明显增特征。细胞核明显增大，核浆比例失调，大，核浆比例失调，核膜完整，双层核膜核膜完整，双层核膜清晰，核异形性明显，清晰，核异形性明显，细胞膜完整，胞质内细胞膜完整，胞质内线粒体肿胀线粒体肿胀 嵴断裂嵴断裂消失，偶见粗面内质消失，偶见粗面内质网，散在核糖体颗粒。网，散在核糖体颗粒。模型组模型组- Lewis肺癌细胞肺癌细胞 辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院结 果线粒体线粒体粗粗面面内内质质网网中药组中药组- 凋亡细胞凋亡细胞 呈现出细胞凋亡早期呈现出细胞凋亡早期的特点。的特点。细胞体积明细胞体积明显缩小，细胞膜结构显缩小，细胞膜结构完整，核膜稍扩张，完整，核膜稍扩张，核形不规整，核内异核形不规整，核内异染色质增多、边集，染色质增多、边集，浓缩成团块状或新月浓缩成团块状或新月状，分布在核膜的内状，分布在核膜的内侧。细胞质内细胞器侧。细胞质内细胞器基本正常。基本正常。H H异染色质异染色质辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院肿瘤细胞透射电镜观察结 果异染色质异染色质化疗组化疗组 - 坏死细胞坏死细胞 细胞体积异常细胞体积异常增大，核大畸增大，核大畸变，胞质内线变，胞质内线粒体、粗面内粒体、粗面内质网扩张，核质网扩张，核糖体颗粒脱落。糖体颗粒脱落。说明存在重度说明存在重度的炎性反应的炎性反应。 辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院肿瘤细胞透射电镜观察结 果中药组中药组 - 凋亡小体凋亡小体 化疗组化疗组 - 凋亡小体凋亡小体 综合组综合组 - 凋亡小体凋亡小体 凋亡小体：由膜包绕，小体内可见核的残片及胞质。凋亡小体：由膜包绕，小体内可见核的残片及胞质。 辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院肿瘤细胞透射电镜观察结 果凋亡小体凋亡小体凋亡小体凋亡小体凋亡小体凋亡小体瘤组织中TNF的免疫组化染色TNF 阴性阴性 (400) TNF 阳性阳性 (400) 细胞浆无棕色与背景着色一致细胞浆无棕色与背景着色一致细胞浆内出现均一的棕黄色细胞浆内出现均一的棕黄色和深棕褐色颗粒状染色和深棕褐色颗粒状染色辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院结 果结 果瘤组织中TNF 的免疫组化染色结果结果分为结果分为4 4级级: : 未见阳性细胞为未见阳性细胞为(-)(-)； 阳性细胞数阳性细胞数 25% 25% 为为(+)(+)；阳性细胞数在；阳性细胞数在 25% 25% 50% 50% 之间为之间为(+)(+)；阳性细胞；阳性细胞 50%50%为为(+)(+)。 组别组别 N TNF染色染色结果结果 模模 型型 组组 10 - 中中 药药 组组 10 + 化化 疗疗 组组 8 - 综综 合合 组组 9 + 辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院1 2 3 4模型组模型组 中药组中药组 化疗组化疗组 综合组综合组Bcl-2、Bax、Caspase3 蛋白表达电泳图蛋白表达电泳图辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院结 果结 果瘤组织中 Bcl-2、Bax 及Caspase3 蛋白表达结果( x S ) 组别组别 N Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Caspase3 模 型 组 10 189.6219.19 78.459.55 2.41 31.124.60 中 药 组 10 178.3418.28 114.4013.59 1.56 47.205.80 化 疗 组 8 158.4516.9 121.6013.381.30 60.657.35 综 合 组 9 145.2214.63 133.614.63 1.08 81.0310.3 与模型组比较： p 0.01， p0.05； 与中药组比较： p0.01， p0.05；与化疗组比较： p0.01， p0.05。辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院结 果瘤组织中 Bcl-2、Bax 及Caspase3 蛋白表达结果与与中药组比较：中药组比较： p 0.01； p 0.05。 辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院www.themegallery.com正气正气内虚内虚 邪毒邪毒血瘀血瘀 痰湿痰湿 讨 论辽宁中医药大学肺的宣发肃降功能失肺的宣发肃降功能失司，司，气机紊乱气机紊乱而发病而发病 肺积的病因病机病因病因www.themegallery.com导致五脏六腑、阴阳气血的功能活动紊乱、障碍, 从而产生相应的种种病理变化。升降出入升降出入动态失衡动态失衡柴胡龙牡汤的理、法、方、药升降平升降平衡理论衡理论 丹溪局方发挥“ 一升一降, 无有偏性, 是谓平人。”讨 论调畅气机调畅气机辽宁中医药大学, 素问六微旨大论“非出入则无以生长壮老已,非升降则无以生长化收藏”气机气机升降升降www.themegallery.com柴胡龙牡汤的理、法、方、药讨 论柴胡龙牡汤软坚散结重镇降逆 升散之力 升降相宜，气机畅达 通利三焦、开三焦之结气。 化痰止咳，可引药于肺经可行气化痰，镇咳止吐一升一降以开宣肺气入肺经，可清肃肺热柴胡 龙骨牡蛎桔梗黄芩半夏调畅气机调畅气机疏肝宣肺疏肝宣肺镇惊安神镇惊安神软坚散结软坚散结辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院讨 论细胞凋亡信号传导途径细胞凋亡信号传导途径讨 论结 论柴胡龙牡汤可诱导Lewis肺癌细胞凋亡，对顺铂化疗具有协同增效作用。 12柴胡龙牡汤可诱导 TNF 产生，下调 Bcl-2 蛋白的表达，明显增加Bax及 Caspase3 的表达，从而使Bcl-2/ Bax 的比值降低，最终导致细胞凋亡。辽宁中医药大学辽宁中医药大学附属医院