第七章、药物生物技术新第七章、药物生物技术新进展进展第二节、转基因技术制药第二节、转基因技术制药一、现代生物技术的定义与主要内容一、现代生物技术的定义与主要内容生物技术生物技术(Biotechnology or Bioengineering）: 对对生生物物有有机机体体（微微生生物物至至高高等等动动、植植物物）或或其其组组成成部部分分（器器官官、组组织织、细细胞胞或或细细胞胞器器等等），运运用用分分子子生生物物学学、细细胞胞生生物物学学、生生物物化化学学、生生物物物物理理学学、生生物物信信息息学学等等手手段段，研研究究、设设计计、改改造造，以以改改良良生生物物乃乃至至创造新的生物品种创造新的生物品种的一种技术体系。的一种技术体系。转基因是指遗传物质在生殖细胞间夸物种的转移。转基因是指遗传物质在生殖细胞间夸物种的转移。转基因技术分为植物转基因技术和动物转基因技术。转基因技术分为植物转基因技术和动物转基因技术。一、生物药物一、生物药物(biopharmaceutics) 一、概念一、概念 利用利用生物体及其成分生物体及其成分综合利用生物学、生物化学、微生物学、生物组织免综合利用生物学、生物化学、微生物学、生物组织免疫学、物理化学、药学原理、方法加工制造的疫学、物理化学、药学原理、方法加工制造的 预防预防 诊断疾病的制品诊断疾病的制品 治疗治疗二、未来医药卫生领域中的生物技术展望二、未来医药卫生领域中的生物技术展望1.转基因动物生产的转基因动物生产的“转基因药物转基因药物” 1978年年 把把人人tPA基基因因转转入入小小鼠鼠受受精精卵卵发发育育成成转转基基因因小小鼠鼠并证明在其乳汁中能得到并证明在其乳汁中能得到tPA 美国美国DNx公司的公司的“制药工厂制药工厂” 转基因猪转基因猪 环球基因药物公司环球基因药物公司 转基因奶牛转基因奶牛 基因酶公司基因酶公司 转基因山羊转基因山羊 英国药物蛋白公司英国药物蛋白公司 转基因绵羊转基因绵羊“转基因药物转基因药物”与基因工程药物相比与基因工程药物相比, 产产量量高高，成成本本低低, 具具有有与与人人体体自自身身产产生生的的蛋蛋白白相相同同的的生生物物学学活活性性。乳乳腺腺细细胞胞能能进进行行一一系系列列的的翻翻译译后后修修饰饰作作用，包括糖基化作用等，正确地产生人体蛋白。用，包括糖基化作用等，正确地产生人体蛋白。2. 人型人型McAb(monoclonal antibody)的制备的制备 技术路线：技术路线： 鼠鼠型型McAb分分子子中中更更换换一一段段人人抗抗体体分分子子中中与与抗抗原原结结合的链段（用蛋白质工程的方法）；合的链段（用蛋白质工程的方法）； 从从人人鼠鼠杂杂交交瘤瘤细细胞胞中中直直接接克克隆隆人人抗抗体体基基因因，并并使使之在细菌中得到表达；之在细菌中得到表达； 将将人人免免疫疫球球蛋蛋白白重重链链C区区基基因因转转入入小小鼠鼠受受精精卵卵，发发育育成成转转基基因因小小鼠鼠，用用特特定定抗抗原原免免疫疫得得人人型型化化McAb 。3. 基因治疗基因治疗 “基因打靶基因打靶”技术技术 将将外外源源基基因因定定点点整整合合到到细细胞胞基基因因组组的的某某一一确确定定位位点上，因而能对缺陷基因进行原位修复。点上，因而能对缺陷基因进行原位修复。转基因植物制药主要内容p1 转基因植物疫苗的概念及其发展历史p2 利用转基因植物生产疫苗的原理及基本方法p3 转基因植物疫苗种类及应用p4 转基因植物疫苗的优点p5 转基因研究中的问题及解决办法 p6 展望1转基因植物疫苗的概念及其发转基因植物疫苗的概念及其发展历史展历史p转基因植物疫苗：利用基因工程技术，将病原微生物的抗原编码基因进行克隆重组,导入植物细胞生成转基因植物,进而表达产物，它能激发粘膜免疫,使机体产生特异性抗病能力 。发展史p1989，Hiat首次在Nature发表了转基因植物疫苗的研究；p1990年,Curtiss等人在烟草种子中表达了具抗原性的变异链球菌表面蛋白获得成功。p1992年,ason等人在烟草中又表达了乙肝表面抗原(BsAg);p至今，有70多篇研究论文发表，有的进入临床阶段。 世 界 第 一 种 口 服 植 物 疫 苗2植物疫苗基本原理及方法p 原理：转基因植物疫苗或植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合,生产出能使机体获得特异性抗病能力的疫苗。n动物试验已证实,转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了免疫学活性,注入动物体内则能产生特异性抗体。 2.12.1利用植利用植物生产疫物生产疫苗的程序苗的程序2.1利用植物生产疫苗的程序p疫苗目的基因的克隆;p高效植物表达载体系统的构建;p植物细胞的遗传转化;p受体细胞的组织培养及植株再生;p抗性植株的筛选和分子鉴定;p转化植株栽培及种植;p目标产品的提取、分离和纯化及免疫学实验等。2.2 主要表达系统p(1)稳定的整合表达系统 ：一般以根癌农杆菌环状Ti质粒上的DNA片断为载体,把编码结构性抗原决定簇参与诱导保护性免疫应答的病原体DNA序列导入植物细胞内,并整合到染色体上,整合了外源基因的植物细胞在一定的条件下长成新植株,这些植株在生长过程中可表达出疫苗,并把这些性状遗传给子代,形成表达疫苗的植物品系。 p(2)瞬时表达系统 ：主要是利用基因工程植物病毒(如烟草花叶病毒、豇豆花叶病毒)为载体,将编码疫苗抗原决定簇基因序列插入植物病毒基因组中,再用此重组病毒感染植物,抗原基因随病毒在植物体内复制、装配而得以高效表达。 3 转基因植物疫苗种类及应用 p1990年,在转基因烟草中用农杆菌介导转化法表达出约占烟草蛋白0.02%的变异链球菌表面蛋白(spaA);pMason(1992)提出了利用转基因植物生产可食用疫苗的概念;p在短短10年左右的时间里,已经有十几种病毒或细菌的抗原基因在转基因植物中获得表达,且基本保留了其天然免疫原性。 报道的植物疫苗主要种类p(1)细菌疫苗:n主要有大肠杆菌热不稳定毒素B亚单位疫苗和霍乱毒素B亚单位疫苗。p(2)病毒疫苗:n目前研制出的病毒疫苗有乙型肝炎疫苗、免出血症病毒疫苗、口蹄疫病毒疫苗、传染性胃肠炎冠状病毒疫苗、狂犬病病毒疫苗、诺沃克病毒疫苗、传染性胃肠炎病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗等。p(3)寄生虫疫苗:n李霞等将疟原虫多表位抗原(AWTE)基因与CT-B基因融合构建植物表达载体转化烟草,经PCR检验证实成功, 经Westernblotting等分析表明特异表达的融合蛋白是CT-B和AWTE基因的结合,具有二者的抗原活性。p(4)避孕疫苗:n 哺乳动物受精过程中精卵结合是具有种属特异性的,这种特异性是由精子表面的特异蛋白与卵细胞透明带ZP3糖蛋白通过受体配体模式进行的。Fitchen等将小鼠ZP3蛋白的一个抗原决定簇融合表达在TMV的衣壳蛋白中,在感染的植物中产生高水平的融合蛋白,用该蛋白免疫小鼠,小鼠体内产生了抗ZP3的特异性血清抗体,能识别ZP3的合成肽。4 转基因植物疫苗的优点p成本低廉；p疫苗易于口服，安全方便；p口服疫苗比传统疫苗更有效；p它能对真核蛋白质进行准确的翻译后加工修饰,使三维空间结构更趋于自然状态 ；p易于存储和分发,无需冷藏设备,可长期随时供给。传统疫苗p经典疫苗制备的基本过程包括：选择适宜的培养基或细胞进行茵、毒株大量繁殖，收集培养物，提纯，半成品捡定，稀释，分装，成品检定；p疫苗的基本成分包抗原、佐剂、防腐剂、稳定剂、灭活剂及其他活性成分。传统疫苗的成份5 转基因研究中的问题及解决办法p重组蛋白的表达问题 （主要）；p重组蛋白的转译后修饰及糖基化问题；p用于口服时易被消化及其作用机理问题；p表达产物的提取加工费用问题； p口服抗原疫苗免疫耐受方面的问题。 重组蛋白的表达问题p 重组蛋白的表达量低,表达效率不稳定n在已报道的研究中,外源基因所表达的重组抗原蛋白,大约只占植物中可溶性蛋白的0.01%0.37%;p转基因沉默n由于外源基因的甲基化及基因共抑制等而使外源基因的表达不稳定.提高表达水平的一些方法p1 优化密码子的使用；p2 启动子的选择；p3 对目的基因进行改造与优化（使用植物偏爱密码子）；p4 特定调控序列的使用（增强子、内含子使用）；p5 消除位置效应（应用核基质结合区以及定点整合技术）；p6 外源蛋白的靶向表达（蛋白体、种子中的质体、叶绿体等）。选择合适启动子p双子叶植物：35启动子；p单子叶植物：Actin、bi启动子；p特异性启动子n种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。p复合式启动子优化密码子p选择植物偏爱的密码子；p外源基因的含量和分布与宿主染色体尽量一致或接近, 防止宿主识别系统对外源基因的甲基化。6 展望p尽管利用转基因植物生产口服疫苗存在许多问题,其前景仍是十分美好的;p对于世界上偏僻落后贫穷的国家和地区的人们、对动荡不安的发展中国家的人们以及发达国家的穷人们而言可以通过服用廉价的植物疫苗获得抵抗疾病的免疫力;p可以肯定,利用转基因植物生产的食用疫苗将成为人类防治疾病的又一有力工具。转基因动物制药动物乳房生物反应器主要内容p1转基因动物制药的发展历史转基因动物制药的发展历史p2转基因动物p3转基因动物怎样生产药物 p4转基因动物制药的优点p5抓住机遇，发展乳腺生物反应器产业1转基因动物制药的发展历史转基因动物制药的发展历史p20世纪70年代后期，随着DNA重组技术的问世，诞生了基因工程药物或称基因药物。高产值、高效率的基因药物的出现给药物生产带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展20世纪70年代后期，随着DNA重组技术的问世，诞生了基因工程药物或称基因药物。高产值、高效率的基因药物的出现给药物生产带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展、极大地加速了基因工程药物的研制进程。在此之前，人们生产基因工程药物的方法，一是微生物基因工程，即把目的基因导入大肠杆菌等工程菌中，通过它表达目的基因蛋白，目前已上市的基因工程药物均采用这一方法；二是细胞基因工程，用哺乳动物细胞株表达目的产物，如生产凝血因子。转基因动物则可将人们所需要的目的基因直接导入鼠、兔、羊、猪等动物体内，使目的基因在其体内表达，从而获得目的产品。转基因动物制药为当今最具发展前景的新药生产方式，兹将国内外近年的研究进展概述如下 2.1转基因动物 p所谓转基因动物，就是用实验的方法将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵内，使外源基因与动物本身的基因(染色体)整合到一起，前者就能随细胞的分裂而增殖，并在体内得到表达，稳定地遗传给后代。1982年世界第一只转基因动物“巨鼠”的产生，就是把大白鼠的生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，将之再导入一“借腹怀孕”的母鼠体内，而生下一只比正常小鼠体格增长一倍的“巨鼠”。 转基因动物与克隆动物截然不同。1996年英国的克隆绵羊“多利”，是把体细胞的核移植到一个去掉细胞核的卵细胞中，组装成一个类似受精卵的细胞，经无性生殖发育而成。转基因羊是将外源基因通过显微注射等方法导入羊受精卵的原核中，然后将之移植到母羊宫腔，让其发育成小羊。出生的小羊带有注射的外源基因，如注有人类凝血因子基因者，子代小羊的乳汁中就有可能含有大量人凝血因子蛋白，提取后即成治疗血友病的基因药物。克隆动物的意义在于突破了有性生殖的框架，证明了高等动物也可无性繁衍；转基因动物则重在它具有的经济价值，可以用来大量廉价地生产出珍贵的药物。2.2转基因动物怎样生产药物 p生物体对能量的利用和转化效率是当今任何机械装置都无法比拟的，因此通过转基因动物来生产药物是迄今最为先进、最有效的系统。动物的乳房是一天然的高效合成蛋白质的生物反应器，产生蛋白质的能力巨大。20世纪80年代中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因，开创了研制动物乳房生物反应器的先河。1991年又在绵羊乳腺中成功表达了这一基因，在这只名为“翠喜”的母羊初乳中，该药品的含量高达35克/升。在动物体内，细胞的分化需要发育基因来调节，这种调节是由多种蛋白质因子对增强区和启动区中成丛的顺式元件进行作用而实现的。用乳汁蛋白质基因的调节元件不仅可能使转基因的表达只限于乳腺组织，而且可能使转基因表达产物得到高水平的表达和大量生产。各种酪蛋白以及乳清蛋白和乳球蛋白等基因的调节元件已相继被克隆并投入使用。目前，已有多种具有生物活性的昂贵的医用蛋白质在转基因动物乳腺中合成并分泌。据美国遗传学会预测，到2005年，全美动物乳房反应器生产的药物年销售额可达350亿美元。到2010年，所有基因工程药物中利用动物乳房生物反应器生产的份额将高达95。2.3转基因动物制药的优点p设备简单、不耗能、无环境污染这一生产方式基本上为一畜牧业过程，虽饲养环境要求特别洁净，但仍是给牛羊草料，由牛羊奶中提取药品，原料生产成本几乎可以忽略不计。动物生产奶蛋白不需昂贵的原料和复杂的设备，不会消耗很多的能源，动物吃饲料，产生的是高营养价值的药用蛋白。 p品种多、产量高、质量优异动物乳房有强大的产奶能力，1头优质乳牛在305天的泌乳期中可产奶10吨，鲜奶含蛋白3.5，每天产蛋白1千克。每只羊每年可产纯蛋白2030千克，即使1只家兔1年亦产纯蛋白2千克。目前国际上已有数十家转基因动物公司，可生产1抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、乳铁蛋白、人血白蛋白、人血红蛋白及人凝血因子、和抗凝血酶、血纤维蛋白原、蛋白质C等十余种稀有药品。这些药物生理活性好，与人同源性高，非常接近天然产品。p生产周期短目前一种新药由研制开发到上市，需1520年，转基因动物制药则可缩短到5年。如以动物生命周期计算，转基因羊从显微注射到泌乳，周期为1.5年，而转基因牛则仅为2529个月。 p4.生产成本低这一制药方式已成为新的巨额经济利润产业，生产成本低而风险极小。如用其它生产工艺(如哺乳动物细胞培养)生产1克药物蛋白，成本需8005000美元，而用转基因动物仅需0.020.5美元。 2.4、抓住机遇，发展乳腺生物反应器产业p自1982年帕尔米特（Palmitar）等首先通过转基因动物技术获得“巨鼠”以来，转基因动物的研究发展迅速，随着遗传学、基因工程和胚胎工程等多学科的发展和相互渗透，目前以显微注射为主要技术手段的转基因基因技术已渐趋成熟，胚胎移植技术也有了明显的提高，同时在深入研究动物乳腺结构和功能的特点以及乳汁分泌的调节等方面积累了相当的经验，越来越多的科学家已开始转向基因动物的研究。到90年代中期，国际上已成立了数十家转基因动物公司，转基因牛、绵羊和猪的成功实例有10多种，生产出贵重的药用蛋白，如-抗胰蛋白酶、乳铁蛋白（Lactoferrin）、人血清白蛋白、人凝血因子、人凝血因子、抗-凝血酶、胶原、血纤蛋白原、LatPA等。一些由转基因家畜乳汁中分离的药物蛋白正用于临床实验。在我国，施履吉院士早在80年代初就提出乳腺生物反应器的构想，并与他的合作者一起成功地获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔，为通过转基因动物的途径获得珍贵药品打下了基础。目前，我国在转基因动物的研究领域，以获得了转基因小鼠、转基因鱼以及转基因猪、转基因羊、转基因鸡等具有快速生长能力或有抗病能力的家畜、家禽种系。90年代，国家“863”高技术计划以将转基因山羊-乳腺生物反应器的研究列入重大项目，并与地方政府（如上海市）密切配合，积极支持我国科学家进行转基因羊的研究开发。令人欣喜的是，上海医学遗传研究所在汲取国内外转基因动物研究经验的基础上。与复旦大学遗传所合作，于1996年10月在上海奉新动物实验场（位于上海奉贤县）成功研制出5头有目的基因（人凝血因子基因）整合的转基因羊（3公2母）（见封面照片），其中1头母羊已于1997年9月产下小羊羔，进入泌乳期，其分泌的乳汁中，含有活性的人凝血因子蛋白，这种凝血因子是治疗血有病的珍贵药材。 2.4、抓住机遇，发展乳腺生物反应器产业p利用转基因动物-乳腺生物反应器生产药物在伦理学及其商品化方面已不存在任何障碍。虽然这项技术的难度较大，成功率只有3%左右，而且目前通过转基因动物-乳腺生物反应器生产的药物尚未形成产业，但预期到本世纪末、21世纪处它们就会鼎足于国际市场。使转基因动物的产业成为最具有高额利润的新型产业。正因为如此，转基因动物的研究和开发已呈现一定的加速状态，竞争也日趋剧烈，欧美一些发达国家的政府和大型制药企业竞相投入句资资助转基因动物-乳腺生物反应器的研究。例如荷兰政府向培育世界上第1头转基因牛的金发马公司首次投资就是1500万美金，美国的金赛姆公司向下属的转基因动物研究中心一次投资就是500万美元用于建造羊舍。转基因动物-乳腺生物反应器是21世纪生物医药产业的一种新的生产模式。处在世纪之交，我国政府和大型制药企业应当抓住有利时机，增加投资强度，加快我国转基因动物-乳腺生物反应器的研究速度，特别是注意生物高新技术的产业化问题，使我国的转基因药物在21世纪的生物医药产业革命中占有一席之地。 pThe end!