基因治疗基因治疗概念美国的联邦食品与药品管理局美国的联邦食品与药品管理局( ( FDA) FDA) 于于1993 1993 年给出的定义是年给出的定义是: : “ “基于修饰活细胞基于修饰活细胞遗传物质遗传物质而进行的而进行的医学干预医学干预。细胞可以体外修饰细胞可以体外修饰, ,随后再随后再注入患者体内；或将基因治疗产品直接注入患者体内；或将基因治疗产品直接注入患者体内注入患者体内, ,使细胞内发生遗传学改使细胞内发生遗传学改变。这种遗传学操纵的目的：预防、治变。这种遗传学操纵的目的：预防、治疗、治愈、诊断或缓解人类疾病疗、治愈、诊断或缓解人类疾病”1 1、体细胞基因治疗体细胞基因治疗 ( ( ( ( somatic gene therapy)somatic gene therapy)somatic gene therapy)somatic gene therapy)治疗基因转移到体细胞内使之表达基因治疗基因转移到体细胞内使之表达基因产物产物, ,以达到治疗目的；以达到治疗目的；只影响受试者本人只影响受试者本人, ,而与后代无关。而与后代无关。2 2、生殖细胞基因治疗生殖细胞基因治疗( ( ( (germlinegermlinegermlinegermline gene gene gene gene therapy)therapy)therapy)therapy) 将治疗基因转移到患者的生殖细胞或早将治疗基因转移到患者的生殖细胞或早期胚胎内的一种基因疗法；期胚胎内的一种基因疗法；永久地改变后代的遗传组成永久地改变后代的遗传组成, ,其目的是其目的是要预防后代患特定的遗传疾病。要预防后代患特定的遗传疾病。生殖细胞基因治疗是体细胞基因治生殖细胞基因治疗是体细胞基因治疗的延伸与扩展；疗的延伸与扩展；各国均各国均禁止禁止将将生殖细胞基因治疗生殖细胞基因治疗用用于临床；于临床；我国于我国于19931993年制定了人的体细胞年制定了人的体细胞治疗和基因治疗临床研究质控要点治疗和基因治疗临床研究质控要点，明确规定仅，明确规定仅能进行体细胞基因能进行体细胞基因治疗治疗。特点特点技术路线的多样性；技术路线的多样性；学科的交叉性；学科的交叉性；高风险性；高风险性； 高度的靶向性高度的靶向性。基因治疗发展经历的基因治疗发展经历的3 3个阶段个阶段第一阶段：第一阶段：第一阶段：第一阶段：70707070年代年代年代年代80808080末，末，末，末，准备准备准备准备时期时期时期时期 又被称为又被称为又被称为又被称为“禁锢时期禁锢时期禁锢时期禁锢时期”第二阶段：第二阶段：第二阶段：第二阶段：19891989198919891995199519951995年，年，年，年，狂热狂热狂热狂热时期时期时期时期 FDA FDA FDA FDA于于于于1989198919891989年批准基因治疗年批准基因治疗年批准基因治疗年批准基因治疗 正式临床试验正式临床试验正式临床试验正式临床试验第三阶段：第三阶段：第三阶段：第三阶段：1996199619961996现在，现在，现在，现在，理性理性理性理性时期时期时期时期 目前目前目前目前中国中国中国中国有有有有 “ “ “ “B B B B型血友病治疗型血友病治疗型血友病治疗型血友病治疗”、 “ “ “ “脑瘤自杀基因治疗脑瘤自杀基因治疗脑瘤自杀基因治疗脑瘤自杀基因治疗”和和和和 “ “ “ “AdAdAdAdP53”P53”P53”P53” 已通过国家药审已通过国家药审已通过国家药审已通过国家药审 进入临床试用进入临床试用进入临床试用进入临床试用基因治疗的3Y原则安全性安全性( (safety) safety) 有效性有效性( (efficacy)efficacy)稳定性稳定性( (stability)stability)伦理原则伦理原则1 1 1 1、最后选择最后选择最后选择最后选择原则原则原则原则某种疾病在所有的疗法均无效或微效时。某种疾病在所有的疗法均无效或微效时。某种疾病在所有的疗法均无效或微效时。某种疾病在所有的疗法均无效或微效时。2 2 2 2、安全安全安全安全原则原则原则原则安全不仅仅针对个体，更重要的是针对人类。安全不仅仅针对个体，更重要的是针对人类。安全不仅仅针对个体，更重要的是针对人类。安全不仅仅针对个体，更重要的是针对人类。3 3 3 3、知情同意知情同意知情同意知情同意原则原则原则原则基因治疗尚处于实验阶段，必须让患者认识到基基因治疗尚处于实验阶段，必须让患者认识到基基因治疗尚处于实验阶段，必须让患者认识到基基因治疗尚处于实验阶段，必须让患者认识到基因治疗可能的危害因治疗可能的危害因治疗可能的危害因治疗可能的危害4 4 4 4、公正公正公正公正原则原则原则原则目前，基因治疗只能用于治病救人目前，基因治疗只能用于治病救人目前，基因治疗只能用于治病救人目前，基因治疗只能用于治病救人5 5 5 5、保密保密保密保密原则原则原则原则患者的遗传信息，尤其是基因缺陷不泄露给外界患者的遗传信息，尤其是基因缺陷不泄露给外界患者的遗传信息，尤其是基因缺陷不泄露给外界患者的遗传信息，尤其是基因缺陷不泄露给外界基因治疗中存在的技术难点基因治疗中存在的技术难点突变基因突变基因定位与定点定位与定点修复技术未解决修复技术未解决, ,不不能去除或纠正异常基因。能去除或纠正异常基因。目前的基因目前的基因导入导入系统尚不成熟系统尚不成熟, ,存在结构存在结构不稳定、影响基因组的功能以及治疗基因不稳定、影响基因组的功能以及治疗基因难以到达靶细胞等隐患；难以到达靶细胞等隐患； 转导的外源性基因在细胞内转导的外源性基因在细胞内表达表达难以控难以控制制, ,有一定的随机性，有激活致癌基因或产有一定的随机性，有激活致癌基因或产生野生型病毒的潜在危害；生野生型病毒的潜在危害；无法保障干预无法保障干预生殖生殖细胞基因而不对后代细胞基因而不对后代产生医源性的伤害。产生医源性的伤害。常用病毒载体系统常用病毒载体系统反转录病毒腺病毒腺相关病毒单纯疱疹病毒（1 1）反转录病毒载体）反转录病毒载体RNARNA病毒病毒, , 基因组大小在基因组大小在8 81111kb kb 之间；之间；以基因组以基因组RNARNA为模板反转录出双链为模板反转录出双链DNADNA；双链双链DNADNA能够随机整合到寄主细胞的染色体能够随机整合到寄主细胞的染色体上上, , 随着寄主细胞的复制而复制。随着寄主细胞的复制而复制。1981198119811981年，年，年，年，WeiWeiWeiWei等构建了第等构建了第等构建了第等构建了第1 1 1 1个反转录病毒载体；临个反转录病毒载体；临个反转录病毒载体；临个反转录病毒载体；临床上应用最多的以小鼠白血病病毒为基本骨架构床上应用最多的以小鼠白血病病毒为基本骨架构床上应用最多的以小鼠白血病病毒为基本骨架构床上应用最多的以小鼠白血病病毒为基本骨架构建的反转录病毒载体。建的反转录病毒载体。建的反转录病毒载体。建的反转录病毒载体。优点优点: :宿主细胞广泛宿主细胞广泛, , 能够感染不同生物种类的多能够感染不同生物种类的多种类型细胞种类型细胞; ; 能高效的感染分裂细胞能高效的感染分裂细胞, , 感染率高感染率高达达100%;100%;能使外源基因能使外源基因整合整合到宿主细胞染色体上。到宿主细胞染色体上。不足之处：不足之处：1)1)不能感染非分裂的细胞不能感染非分裂的细胞; ;2)2)可能产生具有复制能力的病毒可能产生具有复制能力的病毒; ; 3)3)由于是随机整合由于是随机整合, , 可能引起可能引起“插入诱变插入诱变”; ”; 4)4)包装外源包装外源DNADNA能力有限能力有限, , 小于小于8 8 kb; kb; 5)5)要求靶细胞表面要具有反转录病毒的相应要求靶细胞表面要具有反转录病毒的相应受体。受体。新进展1)1)慢病毒载体的研究和应用（慢病毒载体的研究和应用（HIV-HIV-1)1)基因组中存在核定位信号序列基因组中存在核定位信号序列, , 它它能够有效感染并整合到非分裂细胞能够有效感染并整合到非分裂细胞和最终分化的细胞和最终分化的细胞( (除除G G0 0 0 0期期) )2)2)人泡沫病毒人泡沫病毒目前为止，尚未发现有疾病与人泡目前为止，尚未发现有疾病与人泡沫病毒相关沫病毒相关2 2）腺病毒载体）腺病毒载体线性双链的线性双链的DNADNA病毒病毒, , 基因组为基因组为3636kbkb；不整合到宿主细胞染色体上不整合到宿主细胞染色体上, , 而是以染而是以染色体外成分存在；色体外成分存在；上皮细胞、上皮细胞、 角膜和消化道上皮细胞具角膜和消化道上皮细胞具有天然的嗜性；有天然的嗜性；与临床疾病相关的腺病毒通常较温和与临床疾病相关的腺病毒通常较温和, , 很少危及生命。很少危及生命。基因组结构基因组结构基因组结构基因组结构优优优优 点点点点缺缺缺缺 点点点点第第第第一一一一代代代代1. 1. 1. 1. 缺失缺失缺失缺失E1/E1/E1/E1/或和或和或和或和E3E3E3E3区，以便区，以便区，以便区，以便插入外源基因；插入外源基因；插入外源基因；插入外源基因；2.2.2.2.克隆最大克隆最大克隆最大克隆最大容量容量8.58.58.58.5kbkbkbkb；3.E13.E13.E13.E1或或或或/ / / /和和和和E3E3E3E3区由辅助区由辅助区由辅助区由辅助293293293293细细细细胞提供。胞提供。胞提供。胞提供。1.1.1.1.产生野生型病毒率低；产生野生型病毒率低；产生野生型病毒率低；产生野生型病毒率低；2.2.2.2.避免了避免了避免了避免了E1E1E1E1对细胞的转化对细胞的转化对细胞的转化对细胞的转化作用；作用；作用；作用；3.3.3.3.比较安全。比较安全。比较安全。比较安全。1.1.1.1.重组病毒效率低；重组病毒效率低；重组病毒效率低；重组病毒效率低；2.2.2.2.目的基因表达快速衰退；目的基因表达快速衰退；目的基因表达快速衰退；目的基因表达快速衰退；3.3.3.3.产生炎症反应，低水平病毒产生炎症反应，低水平病毒产生炎症反应，低水平病毒产生炎症反应，低水平病毒蛋白表达诱发宿主免疫反应。蛋白表达诱发宿主免疫反应。蛋白表达诱发宿主免疫反应。蛋白表达诱发宿主免疫反应。第第第第二二二二代代代代1.1.1.1.缺失缺失缺失缺失E1-E4E1-E4E1-E4E1-E4；2.2.2.2.改造了改造了改造了改造了293293293293细胞，以包装细胞，以包装细胞，以包装细胞，以包装改进后重组病毒。改进后重组病毒。改进后重组病毒。改进后重组病毒。1.1.1.1.载体容量载体容量载体容量载体容量（11111111kbkbkbkb）；）；）；）；2.2.2.2.细胞毒性、免疫原性细胞毒性、免疫原性细胞毒性、免疫原性细胞毒性、免疫原性1.1.1.1.未延长目的基因表达时间未延长目的基因表达时间未延长目的基因表达时间未延长目的基因表达时间2.2.2.2.病毒滴度仅为第一代病毒滴度仅为第一代病毒滴度仅为第一代病毒滴度仅为第一代1/101/101/101/10- - - -1/1001/1001/1001/100。第第第第三三三三代代代代删除病毒全部删除病毒全部删除病毒全部删除病毒全部E E E E、L L L L基因，只基因，只基因，只基因，只保留保留保留保留ITRITRITRITR和包装信号，又称和包装信号，又称和包装信号，又称和包装信号，又称微小微小微小微小AdAdAdAd（Mini AdMini AdMini AdMini Ad）。）。）。）。1.1.1.1.载体容量载体容量载体容量载体容量（28282828kbkbkbkb）；）；）；）；2.2.2.2.目的基因表达时间目的基因表达时间目的基因表达时间目的基因表达时间；3.3.3.3.细胞毒性、免疫原性细胞毒性、免疫原性细胞毒性、免疫原性细胞毒性、免疫原性。293293细胞细胞 是由人胚肾细胞经是由人胚肾细胞经Ad5 DNAAd5 DNA片段转染后发生转化而形成的细胞，片段转染后发生转化而形成的细胞，该基因组中整合有该基因组中整合有AdE1AdE1区的片段，可持续表达区的片段，可持续表达E1E1区蛋白。区蛋白。优点优点: : 1) 1) 人类是腺病毒的天然宿主人类是腺病毒的天然宿主, , 所以比所以比较较安全安全; ;2) 2) 该病毒在体外该病毒在体外稳定稳定, , 易于制备与纯易于制备与纯化化; ; 3) 3) 宿主范围广宿主范围广, , 既可感染分裂细胞既可感染分裂细胞, , 又可感染非分裂细胞又可感染非分裂细胞; ; 4)4)可原位感染可原位感染, , 特别是肺特别是肺, , 可经口服可经口服, , 喷雾喷雾, , 气管内滴注等气管内滴注等多途径进行治疗多途径进行治疗; ; 5) 5) 外源基因外源基因表达水平较高表达水平较高。不足之处不足之处: :1) 1) 它几乎可以感染所有的细胞它几乎可以感染所有的细胞, , 因此因此缺乏特异性缺乏特异性; ;2) 2) 不能整合到宿主染色体上不能整合到宿主染色体上, , 所所以不能持续表达所需产物以不能持续表达所需产物, , 表达时表达时间短暂间短暂, , 需重复给予载体制剂治疗需重复给予载体制剂治疗; ;3)3)因可能因可能刺激免疫反应刺激免疫反应, , 使反复治使反复治疗的效果会逐渐降低。疗的效果会逐渐降低。（3 3）腺相关（腺伴随）腺相关（腺伴随) )病毒载体病毒载体线性单链的线性单链的DNA DNA 病毒病毒, , 基因组在基因组在4.64.6kbkb; ;繁殖依赖于辅助病毒繁殖依赖于辅助病毒- -腺病毒和疱疹病毒。腺病毒和疱疹病毒。生活周期有两个不同的胞内期生活周期有两个不同的胞内期: :1)1)缺乏辅助病毒时缺乏辅助病毒时, , 腺相关病毒感染宿主腺相关病毒感染宿主细胞细胞, ,其基因组会整合到宿主细胞染色体上其基因组会整合到宿主细胞染色体上, , 形成潜伏感染状态形成潜伏感染状态; ; 2)2)当有辅助病毒感染同一个细胞时当有辅助病毒感染同一个细胞时, , 腺相腺相关病毒基因组关病毒基因组DNADNA就会复制。就会复制。优点优点: : 目前尚未发现该病毒在人体中致病目前尚未发现该病毒在人体中致病, , 所所以比较以比较安全安全; ; 感染感染宿主细胞广泛宿主细胞广泛, ,包括非分裂细胞和包括非分裂细胞和分裂细胞分裂细胞, , 特别是能够感染神经元和神特别是能够感染神经元和神经胶质细胞经胶质细胞; ; 能能特异整合特异整合于人的第于人的第1919号染色体长臂末号染色体长臂末端端, , 减少了插入突变的可能性减少了插入突变的可能性; ; 外源基因外源基因表达稳定表达稳定, 3, 3个月至个月至1.51.5年。年。不足之处：不足之处：难以大量生产难以大量生产 复制需要辅助病毒复制需要辅助病毒 包装外源基因的能力有限包装外源基因的能力有限, , 小于小于5 5 kbkb临床的应用受到一定限制临床的应用受到一定限制亟需建立稳定表达亟需建立稳定表达reprep和和capcap的细胞系，的细胞系，但但reprep表达的毒性可能是其困难所在表达的毒性可能是其困难所在（4 4）单纯疱疹病毒载体）单纯疱疹病毒载体基因组长约152kb的双链DNA病毒；不整合；对非分裂细胞具有天然的亲和力；对神经系统细胞具有嗜向性。多用于帕金森或脑瘤等神经性疾病的治疗；用作基因转移载体的单纯疱疹病毒主要来源于I型单纯疱疹病毒（HSV-1）。优点优点: :宿主宿主范围广范围广, , 包括大量哺乳动物和鸟类的包括大量哺乳动物和鸟类的分裂细胞和非分裂细胞分裂细胞和非分裂细胞; ; 载体载体易于操作易于操作; ; 包装外源基因的能力大包装外源基因的能力大, , 可插入长达可插入长达5050kb kb 的外源基因。的外源基因。不足之处：不足之处：野生型单纯疱疹病毒对人类具有明显的致野生型单纯疱疹病毒对人类具有明显的致病性病性, , 能够从潜伏状态激活能够从潜伏状态激活, , 所以目前仅所以目前仅限于某些恶性肿瘤的临床治疗试验。限于某些恶性肿瘤的临床治疗试验。杆状病毒侵入哺乳动物细胞杆状病毒侵入哺乳动物细胞: :内吞内吞HBVHBV肝靶向性基因治疗载体肝靶向性基因治疗载体用外源目的基因取代一个或多个用外源目的基因取代一个或多个HBV HBV 编码基因编码基因: :S/C/P/X; S/C/P/X; 复制需要通过辅复制需要通过辅助病毒（助病毒（包装信号缺失）基因组的反基因组的反式互补来实现。式互补来实现。血友病的基因治疗血友病的基因治疗血友病B: 人凝血因子IX: Ad-Ad-FIXFIX；AAVAAVhFIXhFIX；反转录病毒临床试验反转录病毒临床试验 ( (复旦薛京伦）复旦薛京伦）血友病A：人凝血因子VIII 地中海贫血的基因治疗珠蛋白基因及其调控序列突变造血干细胞帕金森病（帕金森病（PDPD）的基因治疗的基因治疗酪氨酸羟化酶基因: L-酪氨酸转换成L-dopa神经营养因子基因早老性痴呆（早老性痴呆（AD)AD)的基因治疗的基因治疗淀粉样蛋白 -amiloid precursor protein APP l神经营养因子基因肿瘤基因治疗的基本策略肿瘤基因治疗的基本策略1. 1. 癌基因表达的反义抑制策略癌基因表达的反义抑制策略 利利用用反反义义DNADNA、反反义义RNARNA、核核酶酶( (RibozymeRibozyme) )技技术，抑制癌基因的表达，可以抑制肿瘤。术，抑制癌基因的表达，可以抑制肿瘤。c-mycc-myc的的反反义义核核酸酸在在淋淋巴巴瘤瘤细细胞胞中中有有抗抗增增殖殖活活性。性。以以反反向向K-K-rasras质质粒粒转转染染小小细细胞胞肺肺癌癌细细胞胞株株，抑抑制制了了K-K-rasras的的表表达达，并并且且抑抑制制肿肿瘤瘤在在裸裸鼠鼠体体内内的的生生长长, ,采采用用rasras癌癌基基因因特特异异的的核核酶酶，用用逆逆转转录录病病毒毒导导入入膀膀胱胱癌癌EJEJ细细胞胞，发发现现肿肿瘤瘤细胞的致癌性和转移性均降低了细胞的致癌性和转移性均降低了5050。肿瘤基因治疗的基本策略肿瘤基因治疗的基本策略2 2 抑癌基因克隆和表达策略抑癌基因克隆和表达策略在目前已分离克隆的抑癌基因中，对在目前已分离克隆的抑癌基因中，对在目前已分离克隆的抑癌基因中，对在目前已分离克隆的抑癌基因中，对RBRBRBRB、p53p53p53p53、nm23nm23nm23nm23等在肿瘤治疗方面的作用研究最为深入。等在肿瘤治疗方面的作用研究最为深入。等在肿瘤治疗方面的作用研究最为深入。等在肿瘤治疗方面的作用研究最为深入。恢复视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌等肿瘤细胞中恢复视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌等肿瘤细胞中恢复视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌等肿瘤细胞中恢复视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌等肿瘤细胞中RBRBRBRB基因的表达对于这类肿瘤的治疗具有一定的临基因的表达对于这类肿瘤的治疗具有一定的临基因的表达对于这类肿瘤的治疗具有一定的临基因的表达对于这类肿瘤的治疗具有一定的临床价值床价值床价值床价值；以野生型以野生型以野生型以野生型p53p53p53p53基因替换肿瘤细胞中突变的基因替换肿瘤细胞中突变的基因替换肿瘤细胞中突变的基因替换肿瘤细胞中突变的p53p53p53p53基因基因基因基因是是是是p53p53p53p53基因治疗最基本的应用策略基因治疗最基本的应用策略基因治疗最基本的应用策略基因治疗最基本的应用策略；恢复肿瘤细胞中恢复肿瘤细胞中恢复肿瘤细胞中恢复肿瘤细胞中nm23nm23nm23nm23基因的表达对于防止肿瘤的基因的表达对于防止肿瘤的基因的表达对于防止肿瘤的基因的表达对于防止肿瘤的转移具有积极意义。转移具有积极意义。转移具有积极意义。转移具有积极意义。肿瘤基因治疗的基本策略肿瘤基因治疗的基本策略3.3.宿主免疫功能增强策略宿主免疫功能增强策略向向肿肿瘤瘤细细胞胞和和肿肿瘤瘤浸浸润润淋淋巴巴细细胞胞( (TIL)TIL)中中导导入入细细胞胞因因子子基基因因或或肿肿瘤瘤相相关关性性抗抗原原基基因因、B7B7共共刺刺激激分分子子基基因因等等，可可以以增增强强宿宿主主抗抗肿肿瘤免疫功能。瘤免疫功能。目目前前用用于于临临床床的的细细胞胞因因子子有有IL-2IL-2、TNF-TNF- 、IFN-IFN- 、GM-CSFGM-CSF等。等。肿肿瘤瘤细细胞胞逃逃逸逸机机体体免免疫疫反反应应的的原原因因之之一一是是许许多多肿肿瘤瘤细细胞胞缺缺乏乏B7B7共共刺刺激激分分子子，将将B7B7基基因因导导入入肿肿瘤瘤细细胞胞中中，再再还还输输小小鼠鼠体体内内。无无B7B7的的小小鼠鼠1 1月月后后半半数数致致死死，导导入入B7B7的的小小鼠鼠全全部度过部度过3 3月的实验期。月的实验期。肿瘤基因治疗的基本策略肿瘤基因治疗的基本策略4 .4 .肿瘤治疗药物前体的转换策略肿瘤治疗药物前体的转换策略 又又称称自自杀杀基基因因( (suicide suicide gene)gene)疗疗法法。将将自自杀杀基基因因导导入入细细胞胞中中，这这些些基基因因的的产产物物可可将将无无害害的的药药物物前前体体转转变变为为有有毒毒的的产产物物，从从而而将细胞杀死。将细胞杀死。目目前前常常用用的的自自杀杀基基因因有有单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒的的胸胸苷苷激激酶酶基基因因( (HSV HSV TK)TK)和和细细菌菌的的胞胞嘧嘧啶啶脱脱氨氨酶酶基基因因( (CD) CD) 。TKTK能能将将无无毒毒的的GCVGCV转转化化为为有有毒毒的的三三磷磷酸酸GCVGCV，CDCD能能催催化化5-5-氟氟胞胞嘧嘧啶啶转转化化为为5 5氟氟尿尿嘧嘧啶啶。这这些些转转化化产产物物在在DNADNA复复制制时掺入时掺入DNADNA分子中，抑制了分子中，抑制了DNADNA的合成的合成。肿瘤基因治疗的基本策略肿瘤基因治疗的基本策略 5.5.多药抗性基因的转移策略多药抗性基因的转移策略 肿瘤化疗的最大副作用就是骨髓抑制。将多药 抗 性 基 因 (multi-drug resistance gene,MDR)导入骨髓干细胞，可以控制化疗的副作用。MDR1基因编码170KD的跨膜P-糖蛋白，作为能量依赖性的药物外运泵，能将化疗药物驱逐出胞外，使细胞获得抗药表型。这一策略能使骨髓耐受大剂量化疗。