用荧光分光光度法测定中药配用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用方颗粒对自由基的清除作用 答辩人：张承答辩人：张承导师：蔡继文教授导师：蔡继文教授用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用一一选题意义选题意义1. 自由基是一种外层轨道上含有未配对电子自由基是一种外层轨道上含有未配对电子的原子、原子团或呈特殊状态的分子。的原子、原子团或呈特殊状态的分子。2. 机体内自由基大量产生或清除过缓机体内自由基大量产生或清除过缓,使积使积累超过临界水平后累超过临界水平后, 就会对机体产生损伤，就会对机体产生损伤，各种炎症、癌症、脏器损伤、老化等都与各种炎症、癌症、脏器损伤、老化等都与自由基密切相关自由基密切相关 。( (一一) ) 自由基概述及其危害自由基概述及其危害用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用( (二二) ) 中药以及中药配方颗粒中药以及中药配方颗粒 中药抗氧化剂具有经济和毒、副作用小等中药抗氧化剂具有经济和毒、副作用小等明显的优点明显的优点, 在中草药中在中草药中, 有许多药物都对自有许多药物都对自由基有清除作用由基有清除作用。 中药配方颗粒品质优良，效果客观，使用中药配方颗粒品质优良，效果客观，使用简便快捷，必将成为简便快捷，必将成为21世纪中医药配方的主流。世纪中医药配方的主流。因此研究它的药性有着重要的意义。因此研究它的药性有着重要的意义。用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用( (三三) ) 测定自由基清除率的方法测定自由基清除率的方法 电子自旋共振法、高效液相色谱法、电子自旋共振法、高效液相色谱法、化学发光法、紫外分光光度法、荧光分化学发光法、紫外分光光度法、荧光分光光度法等。光光度法等。 本实验采用用仪器简单，操作方便的本实验采用用仪器简单，操作方便的荧光分光光度法对中药消除自由基的性荧光分光光度法对中药消除自由基的性能进行研究。能进行研究。用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用1.1.实验原理实验原理 Fe2+EDTA在弱碱性介质中可还原溶解氧产生在弱碱性介质中可还原溶解氧产生 OH，其进攻对苯二甲酸产生强荧光羟基化产物，其进攻对苯二甲酸产生强荧光羟基化产物2羟基对苯二甲酸羟基对苯二甲酸(HOTP) . OH清除剂加入后清除剂加入后, 导导致致HOTP 的生成量减少的生成量减少,从而体系荧光强度明显降从而体系荧光强度明显降低。低。二二实验内容实验内容用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用2. 仪器仪器 日本日本 岛津岛津RF-5301PC荧光分光光度计，激发荧光分光光度计，激发波长波长316 nm，测定发射光谱，测定发射光谱 。 3. 试剂及反应体系试剂及反应体系 对对苯苯二二甲甲酸酸钠钠溶溶液液(1. 0 10- 4 mol/ L); Fe2 + ( 硫硫酸酸亚亚铁铁溶溶液液,1. 0 10- 3 mol/ L)； EDTA(1. 0 10- 3 mol/ L)；磷磷酸酸钠钠缓缓冲冲溶溶液液(0. 2 mol/ L ;pH =7. 4) , 山山茱萸等中药配方颗粒。茱萸等中药配方颗粒。 依依次次加加入入对对苯苯二二甲甲酸酸溶溶液液0.50 mL, EDTA 溶溶液液0. 3 mL, 中中药药颗颗粒粒溶溶液液0.50.5mL；Fe2 + 溶溶液液0.30 mL, 缓缓冲冲液液2.00 mL ,稀稀释释至至10.0 mL ,反反应应6 min后后测测定定体体系系荧荧光光强度。强度。用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用4.4.实验内容及其结果讨论实验内容及其结果讨论(1).(1).不加中药时体系的发射光谱不加中药时体系的发射光谱123 由此可见由此可见, ,羟基对苯二甲酸是体系的唯一的强荧光物质，羟基对苯二甲酸是体系的唯一的强荧光物质，自由基或者是对苯二甲酸本身不产生荧光。峰值位置为自由基或者是对苯二甲酸本身不产生荧光。峰值位置为426nm 426nm 1:对苯二甲酸+Fe2+EDTA 2:与1相比,无对苯二甲酸钠 3:与1相比,体系中没有加入Fe2+用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用(2)(2)测定中药自身的发射光谱，激发波长测定中药自身的发射光谱，激发波长316nm316nm 为减小误差，选择了在为减小误差，选择了在426nm处的荧处的荧光强度值相对较小的中药光强度值相对较小的中药: 半支莲，山茱萸，茶多酚，黄芩，半支莲，山茱萸，茶多酚，黄芩，红花，桂枝，地龙，柴胡，猪苓红花，桂枝，地龙，柴胡，猪苓用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用(3)(3)对各种中药进行抑制自由基的测定对各种中药进行抑制自由基的测定无中药 荧光强度F0 用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用中药名中药名C=C= 0.03g/L中药自身荧中药自身荧光强度光强度F 加入中药后加入中药后荧光强度荧光强度F 清除率（）清除率（）F0-(F- F)/F)/F0 0 黄芩黄芩63.803154.98474.1红花红花109.52241.01662.6桂枝桂枝83.272211.28463.6地龙地龙88.537233.33858.8柴胡柴胡87.727231.92359.0猪苓猪苓59.979217.03555.3各种中药对自由基的清除率各种中药对自由基的清除率用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用(4)用不同浓度的半支莲，山茱萸和茶多酚进行研究用不同浓度的半支莲，山茱萸和茶多酚进行研究 无中药半支莲对自由基的抑制作用半支莲对自由基的抑制作用用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用山茱萸对自由基的抑制作用山茱萸对自由基的抑制作用 无中药用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用茶多酚对自由基的抑制作用。茶多酚对自由基的抑制作用。 无中药用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用（5).5).山茱萸和半支莲不同比例的混合物对自由基的山茱萸和半支莲不同比例的混合物对自由基的 抑制作用抑制作用 荧荧光光强强度度值值没没有有明明显显的的提提高高或或降降低低，没没有有发发现现有明显的协同或负协同效应。有明显的协同或负协同效应。空白用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用茶多酚茶多酚 半支莲半支莲 山茱萸山茱萸 浓度浓度/g/l F 清除清除率率/% 浓度浓度/g/l F 清除清除率率/% 浓度浓度/g/l F 清除清除率率/% 0.10189.573.60.10120.346.70.10200.577.90.08175.4 68.10.08131.251.00.06189.973.80.06159.1 61.80.06118.946.20.04170.466.20.04143.7 55.80.04129.950.50.02141.354.90.02126.2 49.00.01103.540.20.0193.3236.20.008113.644.10.00886.833.70006100.039.00.00685.933.40.00497.437.80.00480.431.20.00288.434.40.00273.528.5不同浓度的中药及其清除率不同浓度的中药及其清除率用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用5. 数据处理数据处理茶多酚半支莲山茱萸斜率 3.07相 关 系 数0.999斜率 15.3相关系数 0.974斜率 8.94相关系数0.978用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用1 1用用对苯二甲酸羟基化反应体系可以评价中药对苯二甲酸羟基化反应体系可以评价中药清除清除 OH 的作用能力。可以粗略的得到一定的作用能力。可以粗略的得到一定浓度下各种中药的清除率。浓度下各种中药的清除率。2 2可以看出在一定的浓度范围内，中药颗粒浓可以看出在一定的浓度范围内，中药颗粒浓度与其清除率大致成线性比例。度与其清除率大致成线性比例。3 3在较高浓度范围山茱萸的清除自由基能力好在较高浓度范围山茱萸的清除自由基能力好于半支莲，而在低浓度时相反。于半支莲，而在低浓度时相反。三三 实验结论实验结论用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用创新点创新点 当前对中药的提取物的清除自由基当前对中药的提取物的清除自由基研究已经比较多。而对使用的越来越广研究已经比较多。而对使用的越来越广泛的中药配方颗粒的清除自由基的研究泛的中药配方颗粒的清除自由基的研究报道较少。本实验采用了市售的中药颗报道较少。本实验采用了市售的中药颗粒配方进行研究。粒配方进行研究。用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用致谢致谢 感谢导师蔡继文教授给我这样一个感谢导师蔡继文教授给我这样一个独立的科学探索的机会，感谢实验室所独立的科学探索的机会，感谢实验室所有的师兄师姐对我的帮助，特别要感谢有的师兄师姐对我的帮助，特别要感谢梁建洪师兄和周悦芸同学。最后要感谢梁建洪师兄和周悦芸同学。最后要感谢化学院创新研究基金的大力支持。化学院创新研究基金的大力支持。用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用用荧光分光光度法测定中药配方颗粒对自由基的清除作用