第三章第三章 抗体制药抗体制药（二）（二）3 3学时学时三、多功能抗体及其制备三、多功能抗体及其制备n近年来，在近年来，在scFv（单链抗体）的基础上，可（单链抗体）的基础上，可以把两个或两个以上的以把两个或两个以上的scFv重组在一起，由重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。（简称多价微抗）。n包括双链抗体（包括双链抗体（diabody），三链抗体），三链抗体（triabody），微型抗体（），微型抗体（minibody）及四）及四链抗体（链抗体（tetrabody）。）。2第三章 抗体制药多功能抗体及其制备多功能抗体及其制备n双链抗体制备方法双链抗体制备方法：化学交联法、粘性蛋白结：化学交联法、粘性蛋白结构域融合法和接头长度控制法。构域融合法和接头长度控制法。n微型抗体微型抗体：通过基因工程手段采用不同的接头把：通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体（单链抗体（VL-VH)VL-VH)的的VHVH结构域与结构域与IGIG的的CHCH3 3结构域融结构域融合，形成合，形成VL-VH-CHVL-VH-CH3 3的结构。此种抗体合成后通过的结构。此种抗体合成后通过CH3CH3结构域形成稳定的二聚体形式，发挥其双价微结构域形成稳定的二聚体形式，发挥其双价微抗的作用。抗的作用。n三链抗体三链抗体：在制备单链抗体时，当接头的长度为：在制备单链抗体时，当接头的长度为2 2个或个或2 2个以下氨基酸残基时，或者直接把个以下氨基酸残基时，或者直接把VHVH结构结构域域N N末端与末端与VLVL结构域结构域C C末端相连，通过非共价键而末端相连，通过非共价键而形成三聚体，称三链抗体。形成三聚体，称三链抗体。3第三章 抗体制药 4第三章 抗体制药抗体融合蛋白抗体融合蛋白n抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性，称之为抗体融合蛋白。新的特性，称之为抗体融合蛋白。n根据构建方式的不同，抗体融合蛋白主要分为两种形式：根据构建方式的不同，抗体融合蛋白主要分为两种形式：5第三章 抗体制药构建抗体融合蛋白的原则构建抗体融合蛋白的原则 n将第一个蛋白的终止密码子删除，再将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因的共表达。因，即可实现两个基因的共表达。n抗体酶，酶抗体酶，酶- -抗体型融合蛋白，在药物抗体型融合蛋白，在药物治疗中有广阔的前景，它可在靶向位治疗中有广阔的前景，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，置上将前体药物转化成有效的药物，从而避免了对正常组织的损害。从而避免了对正常组织的损害。6第三章 抗体制药四、基因工程抗体和抗体工程四、基因工程抗体和抗体工程n抗体研究的三大阶段：抗体研究的三大阶段： 18901890年白喉抗毒素年白喉抗毒素多克隆抗体多克隆抗体； 19751975年杂交瘤技术年杂交瘤技术单克隆抗体单克隆抗体； 19941994年开始年开始基因工程抗体基因工程抗体n基因工程抗体基因工程抗体：不用人工免疫动物和细胞不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能利用基因转移和表达技性抗体，而且还能利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动物、植物大术，通过细菌发酵或转基因动物、植物大规模生产抗体。规模生产抗体。7第三章 抗体制药 8第三章 抗体制药噬菌体抗体库技术的基本方法噬菌体抗体库技术的基本方法 n获取目的基因获取目的基因n抗体库技术的载体抗体库技术的载体n淘筛淘筛n表达与鉴定表达与鉴定9第三章 抗体制药获取目的基因和载体获取目的基因和载体n获取目的基因获取目的基因：提取：提取mRNA mRNA 经反转经反转录录PCRPCR获取抗体某一特定基因区段，获取抗体某一特定基因区段，抗体基因的组合形式多为单链抗体。抗体基因的组合形式多为单链抗体。n抗体库技术的载体抗体库技术的载体：噬菌体载体具：噬菌体载体具有噬菌体和质粒的共同特点。有噬菌体和质粒的共同特点。 10第三章 抗体制药淘筛、表达与鉴定淘筛、表达与鉴定n淘筛：淘筛：抗原固相化后，对噬菌粒群的抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，反复使目的克隆大量扩增。库，反复使目的克隆大量扩增。n表达与鉴定表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌，进行可溶性表达。再导入感受态菌，进行可溶性表达。 11第三章 抗体制药噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术12第三章 抗体制药噬菌体抗体库的分类噬菌体抗体库的分类13第三章 抗体制药噬菌体展示技术噬菌体展示技术14第三章 抗体制药 15第三章 抗体制药噬菌体抗体库技术的特点噬菌体抗体库技术的特点n模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库n避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术n可获得高亲和力的人源化抗体。可获得高亲和力的人源化抗体。16第三章 抗体制药噬菌体展示技术最关键的优势噬菌体展示技术最关键的优势17第三章 抗体制药噬菌体抗体库技术的优势噬菌体抗体库技术的优势18第三章 抗体制药单克隆抗体杂交瘤技术和噬菌体抗体展示技术比较单克隆抗体杂交瘤技术和噬菌体抗体展示技术比较19第三章 抗体制药基因工程抗体的表达基因工程抗体的表达 n原核生物：大肠杆菌，分原核生物：大肠杆菌，分 融合表达和分泌融合表达和分泌表达；表达；n真核生物：都是分泌表达，有酵母、昆虫真核生物：都是分泌表达，有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌。细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌。n转基因植物：转基因植物： 烟草烟草n转基因动物：单基因水平。转基因动物：单基因水平。20第三章 抗体制药抗体在体外人源化存在的问题抗体在体外人源化存在的问题n操作过程复杂操作过程复杂n成本高成本高n抗体的亲和力降低抗体的亲和力降低n抗体不是人体免疫系统自然产生抗体不是人体免疫系统自然产生n异源抗体与免疫系统的配合异源抗体与免疫系统的配合21第三章 抗体制药 n最理想的单克隆抗体：最理想的单克隆抗体：100100人源化，由人体免疫系统自然产生人源化，由人体免疫系统自然产生。n全人抗体的理论基础：全人抗体的理论基础：癌症、病毒、细菌对机体而言均为异己物；癌症、病毒、细菌对机体而言均为异己物；人体不断受异己物攻击，但免疫系统通常有人体不断受异己物攻击，但免疫系统通常有清除能力；清除能力；免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己物免疫系统通过体液免疫和细胞免疫对异己物做出反应；做出反应；体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体。体液免疫就是针对异己物天然地产生抗体。n全人抗体面临的关键问题：全人抗体面临的关键问题：持续分泌抗持续分泌抗体的人体的人B B细胞、抗体分泌细胞的保持。细胞、抗体分泌细胞的保持。22第三章 抗体制药 23第三章 抗体制药 24第三章 抗体制药 25第三章 抗体制药 26第三章 抗体制药 27第三章 抗体制药 28第三章 抗体制药 29第三章 抗体制药 30第三章 抗体制药五、抗体诊断试剂五、抗体诊断试剂n抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都可呈现某种反应。可呈现某种反应。n在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，可作为药物用于治疗；中和毒素等作用，可作为药物用于治疗；n在体外可发生凝集或沉淀等反应，可用已在体外可发生凝集或沉淀等反应，可用已知抗体来鉴定抗原，作病原学的诊断和血知抗体来鉴定抗原，作病原学的诊断和血型测定。型测定。31第三章 抗体制药抗体诊断药物分类抗体诊断药物分类 三类：三类：n 血清学鉴定用的抗体类试剂血清学鉴定用的抗体类试剂n 免疫标记技术用的抗体类试剂免疫标记技术用的抗体类试剂n 导向诊断药物导向诊断药物32第三章 抗体制药血清学鉴定用的抗体类试剂血清学鉴定用的抗体类试剂 血清学鉴定血清学鉴定 是指用已知抗体来鉴定未知的抗原是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。常用凝集反应。和血型鉴定。常用凝集反应。33第三章 抗体制药鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂n用单克隆抗体可以检测出多种病毒中用单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异；非常细微的株间差异；n鉴定细菌的种型和亚种，这是传统血鉴定细菌的种型和亚种，这是传统血清法或动物免疫幅所做不到的，而且清法或动物免疫幅所做不到的，而且诊断异常准确。诊断异常准确。n还可以检查出某些还尚无临床表现的还可以检查出某些还尚无临床表现的极小肿瘤病灶，检测心肌梗死的位置极小肿瘤病灶，检测心肌梗死的位置和面积，为有效治疗提供方便。和面积，为有效治疗提供方便。34第三章 抗体制药常用品种和用途常用品种和用途 n 诊断血清诊断血清n 分群血清分群血清n 分型血清分型血清n 因子血清因子血清n 沙门氏菌属诊断血清沙门氏菌属诊断血清n志贺氏菌属诊断血清志贺氏菌属诊断血清n 病原性大肠埃希氏菌诊断血清病原性大肠埃希氏菌诊断血清35第三章 抗体制药诊断血清的制备步骤诊断血清的制备步骤n制备细菌抗原制备细菌抗原：细菌接种、培养、收集菌：细菌接种、培养、收集菌苔、制成菌液；苔、制成菌液；n免疫动物和制备抗体血清免疫动物和制备抗体血清：动物有家兔、：动物有家兔、马、羊、豚鼠；马、羊、豚鼠；免疫途径免疫途径：静脉、腹腔、：静脉、腹腔、皮下。接种次数皮下。接种次数37次，每次间隔次，每次间隔34天，天，末次注射后末次注射后68天取血样测效价，达到要天取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。求，即可采血，离心分离血清。n诊断血清的诊断方法：直接凝集反应诊断血清的诊断方法：直接凝集反应36第三章 抗体制药 37第三章 抗体制药乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂 38第三章 抗体制药妊娠诊断试剂妊娠诊断试剂 n妇女妊娠后，血液和尿液中的妇女妊娠后，血液和尿液中的HCGHCG（human human chorionic chorionic gonadotrophingonadotrophin，人绒毛膜促性，人绒毛膜促性腺激素）含量增高，在腺激素）含量增高，在3 3个月内达到高峰。个月内达到高峰。n此时检测尿液中的此时检测尿液中的HCGHCG，就可确定是否怀孕。，就可确定是否怀孕。39第三章 抗体制药抗ABO血型系统血清n按照人红细胞带有的按照人红细胞带有的A A或或B B种凝集原，可将血型分种凝集原，可将血型分为为A A、B B、ABAB和和O O型型4 4种。种。nABOABO血型抗血清的制备：血型抗血清的制备：1 1、人源性、人源性ABO ABO 血型抗血清是采集健康献血人的血液，血型抗血清是采集健康献血人的血液，凝固后，置凝固后，置4 4 度过夜，使冷抗体吸附在血块上一度过夜，使冷抗体吸附在血块上一起除掉。起除掉。2 2、动物源性、动物源性ABO ABO 血型抗血清是用人血型物质血型抗血清是用人血型物质A A 和和B B 免疫马得到的。免疫马得到的。3 3、单克隆抗体是应用、单克隆抗体是应用B B淋巴细胞杂交瘤技术生产抗淋巴细胞杂交瘤技术生产抗A A 或抗或抗B B血清。血清。n血型鉴定的方法：玻片直接凝集法。血型鉴定的方法：玻片直接凝集法。 40第三章 抗体制药 41第三章 抗体制药免疫标记技术用的抗体类试剂免疫标记技术用的抗体类试剂n给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗体进行定性的反应得以显现，可对微量抗体进行定性定量测定，灵敏度高。定量测定，灵敏度高。n结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。织内或细胞内的定位测定。n除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供手段。手段。42第三章 抗体制药荧光抗体诊断试剂荧光抗体诊断试剂n是用荧光色素，如异硫氰酸荧光素是用荧光色素，如异硫氰酸荧光素（FITCFITC）、罗丹明（）、罗丹明（RB200RB200）、藻红素）、藻红素（PEPE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。n用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在显微或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。定位的目的。43第三章 抗体制药免疫酶抗体诊断试剂免疫酶抗体诊断试剂n用酶标记抗体来检测抗原，有免疫酶染法用酶标记抗体来检测抗原，有免疫酶染法和酶免疫测定。和酶免疫测定。n目前有：目前有： HBsAg酶标诊断试剂、酶标诊断试剂、HBeAg酶酶标诊断试剂、标诊断试剂、HAVAg（甲型肝炎病毒抗原）（甲型肝炎病毒抗原） 酶标诊断试剂、测定酶标诊断试剂、测定HIV（人免疫缺陷病毒）（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标抗体诊断试剂、甲胎蛋白抗原的酶标抗体诊断试剂、甲胎蛋白（AFP）酶标抗体诊断试剂、癌胚抗原）酶标抗体诊断试剂、癌胚抗原（CEA）的酶标抗体诊断试剂。）的酶标抗体诊断试剂。44第三章 抗体制药放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫用抗体诊断试剂 n放射免疫技术是将放射性核素分析的高放射免疫技术是将放射性核素分析的高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技术。能测出起来建立的检测技术。能测出ngng/ml/ml，甚至甚至pg/mlpg/ml水平的微量抗原物质。水平的微量抗原物质。45第三章 抗体制药导向诊断药物导向诊断药物n以抗体为载体的导向诊断药物的研究比导以抗体为载体的导向诊断药物的研究比导向治疗更接近临床应用阶段。向治疗更接近临床应用阶段。n放射性免疫显像的优点：在体内有确切定放射性免疫显像的优点：在体内有确切定位肿瘤的作用；在体内可检出位肿瘤的作用；在体内可检出0.5 0.5 厘米大厘米大小的病灶；小分子抗体容易到达肿瘤部位；小的病灶；小分子抗体容易到达肿瘤部位；抗体在肿瘤部位可保留抗体在肿瘤部位可保留6-9 6-9 日；能观察抗日；能观察抗体在血中的半衰期和可能出现的不良反应。体在血中的半衰期和可能出现的不良反应。46第三章 抗体制药六、抗体治疗药物六、抗体治疗药物n以抗体为载体的导向治疗药物研究已有以抗体为载体的导向治疗药物研究已有2020多年的多年的历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十历史，已制备出百余种单克隆抗体，鉴定出数十种与肿瘤有关的抗原，受试病人超过数千例。种与肿瘤有关的抗原，受试病人超过数千例。n但治疗用的制剂尚没有一种达到商品化的程度。但治疗用的制剂尚没有一种达到商品化的程度。n在治疗药物中，单克隆抗体与毒素的偶联物治疗在治疗药物中，单克隆抗体与毒素的偶联物治疗淋巴瘤效果最佳，但有效率仅淋巴瘤效果最佳，但有效率仅3030。n目前的客观现实目前的客观现实：研究进展迅速，但未达到常规：研究进展迅速，但未达到常规治疗的应用阶段。治疗的应用阶段。n原因原因：抗体相对分子量大，穿透力低，不能达到：抗体相对分子量大，穿透力低，不能达到靶部位或摄取量低；鼠源性抗体的排斥反应。靶部位或摄取量低；鼠源性抗体的排斥反应。47第三章 抗体制药放射性核素标记的抗体治疗药物放射性核素标记的抗体治疗药物n抗体作为放射性核素的导向载体。抗体作为放射性核素的导向载体。n操作简单、用量小，且能观察到药物在体操作简单、用量小，且能观察到药物在体内的分布和药物动力学。内的分布和药物动力学。n放射性标记的抗体有较大的杀伤范围，有放射性标记的抗体有较大的杀伤范围，有利于克服肿瘤表面抗原的异质性，对肿瘤利于克服肿瘤表面抗原的异质性，对肿瘤细胞的杀伤也不依赖抗原抗体结合后的吸细胞的杀伤也不依赖抗原抗体结合后的吸收作用，由于分子量小，容易穿透到达肿收作用，由于分子量小，容易穿透到达肿瘤部位。瘤部位。 48第三章 抗体制药抗癌药物偶联的抗体药物抗癌药物偶联的抗体药物 n常用抗癌药常用抗癌药 氨甲喋呤、阿霉素、丝裂氨甲喋呤、阿霉素、丝裂霉素、环磷酰胺等，以人血清白蛋白霉素、环磷酰胺等，以人血清白蛋白为中间载体，可明显提高每分子抗体为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的氨甲喋呤量，使体外细胞毒所携带的氨甲喋呤量，使体外细胞毒性提高倍。性提高倍。n抗体类药物的逆转耐药性抗体类药物的逆转耐药性 肿瘤细胞对肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性。抗原药物可产生多药耐药性。 49第三章 抗体制药抗体类药物逆转耐药性抗体类药物逆转耐药性n肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药性（MDRMDR）。）。nMDRMDR是由基因调控的，其编码蛋白称为是由基因调控的，其编码蛋白称为P P糖糖蛋白，其中蛋白，其中P170P170是与肿瘤耐药相关的主要是与肿瘤耐药相关的主要蛋白，由蛋白，由Mdr1Mdr1基因编码，基因编码，12801280氨基酸残基，氨基酸残基，分子量分子量170K170K。n认为认为P P蛋白是蛋白是ATPATP酶依赖性药泵，药物进入酶依赖性药泵，药物进入细胞后与细胞后与P P蛋白结合，利用蛋白结合，利用ATPATP水解释放的水解释放的能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积减能量将药物泵出胞外，使胞内药物蓄积减少，因而产生耐药性少，因而产生耐药性。50第三章 抗体制药毒素偶联的抗体药物毒素偶联的抗体药物 n免疫毒素及其换代制品免疫毒素及其换代制品 毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。第一代第一代免疫免疫毒素是包含有毒素是包含有A A、B B 链的完整的毒素和抗体的交联链的完整的毒素和抗体的交联物，应用有限，物，应用有限，第二代第二代免疫毒素利用抗体或抗体免疫毒素利用抗体或抗体片段与毒素作用，在体内有一定的抗肿瘤作用；片段与毒素作用，在体内有一定的抗肿瘤作用；第三代第三代免疫毒素重组免疫毒素，特异性好，稳免疫毒素重组免疫毒素，特异性好，稳定性强，渗透性好，免疫原性低，可大量制备。定性强，渗透性好，免疫原性低，可大量制备。51第三章 抗体制药免疫毒素的制备免疫毒素的制备 n来源：来源：主要是细菌毒素和植物毒素。主要是细菌毒素和植物毒素。n载体种类载体种类：小分子抗体：小分子抗体FVFV和和SCFVSCFV；细胞生；细胞生长因子可与细胞膜上的受体结合；激素，长因子可与细胞膜上的受体结合；激素，可识别细胞表面的受体；可识别细胞表面的受体；CD4CD4可识别可识别HIVHIV表表达的糖蛋白。达的糖蛋白。n先克隆出细胞基因，再利用基因重组技术先克隆出细胞基因，再利用基因重组技术去除毒素中非特异性结合部位基因，经过去除毒素中非特异性结合部位基因，经过改造的毒素基因再与载体基因的互补改造的毒素基因再与载体基因的互补DNA DNA 重组，转入受体菌中表达，形成融合蛋白，重组，转入受体菌中表达，形成融合蛋白，再经纯化可得到重组的免疫毒素。再经纯化可得到重组的免疫毒素。52第三章 抗体制药免疫毒素的临床应用免疫毒素的临床应用 n可用于治疗肿瘤、自身免疫病、并能可用于治疗肿瘤、自身免疫病、并能克服组织移植排斥反应。克服组织移植排斥反应。n可单独给药也可包裹在脂质体及其他可单独给药也可包裹在脂质体及其他微粒中给药，在胞浆物质代谢中发挥微粒中给药，在胞浆物质代谢中发挥作用。作用。n对分子量小，渗透力强、效果好。对分子量小，渗透力强、效果好。 53第三章 抗体制药单克隆抗体生产工艺实例单克隆抗体生产工艺实例 抗抗HBsAg的单克隆抗体生产工艺的单克隆抗体生产工艺n抗乙型肝炎表面抗原抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)单克隆抗体是单克隆抗体是专一性识别专一性识别HBsAg 的单一抗体，能与的单一抗体，能与HBsAg 产生免疫反应。产生免疫反应。 n临床上用于检测乙型肝炎病毒的感染并用临床上用于检测乙型肝炎病毒的感染并用于生产预防乙肝的免疫制剂。目前生产抗于生产预防乙肝的免疫制剂。目前生产抗HBsAg的单克隆抗体技术有基因工程与细的单克隆抗体技术有基因工程与细胞工程。胞工程。54第三章 抗体制药 免疫大鼠脾淋巴细胞与大鼠骨免疫大鼠脾淋巴细胞与大鼠骨髓瘤的髓瘤的IR983F IR983F 细胞融合技术制细胞融合技术制造抗造抗HBsAgHBsAg单克隆抗体的工艺。单克隆抗体的工艺。55第三章 抗体制药工艺流程工艺流程 大鼠骨髓瘤细胞大鼠骨髓瘤细胞免疫大鼠脾淋巴细胞免疫大鼠脾淋巴细胞融合混合物融合混合物杂种细胞杂种细胞混合物混合物杂交瘤杂交瘤克隆系克隆系细胞细胞种质种质培养液粗制培养液粗制McAb层析液层析液浓缩液浓缩液 McAb精品精品56第三章 抗体制药工艺过程工艺过程 n培养基培养基 大鼠骨髓瘤大鼠骨髓瘤IR983 F 细胞系的培养基为改良细胞系的培养基为改良的的DMEM培养甚。是使培养甚。是使Eagle培养基中培养基中15 种种氨基酸浓度增加氨基酸浓度增加l 倍，倍，8 种维生素浓度增加种维生素浓度增加3 倍而成，用于细胞培养，提高了细胞生长倍而成，用于细胞培养，提高了细胞生长效果。效果。 其中尚需其中尚需10%灭活小牛血清，灭活小牛血清，1%非必需氨非必需氨基酸，基酸，0.1molL 丙酮酸钠，丙酮酸钠，1%谷氨酰胺谷氨酰胺及及50mgmI 庆大霉素；杂交瘤细胞筛选系庆大霉素；杂交瘤细胞筛选系统用含统用含HAT 的的DMEM 培养基。培养基。 57第三章 抗体制药 n饲养细胞制备饲养细胞制备： 在细胞融合前在细胞融合前23 天，取健康大鼠处死，天，取健康大鼠处死，向腹腔内注入向腹腔内注入10mlDMEM 培养液轻压腹培养液轻压腹腔使细胞悬浮，打开腹壁皮肤，暴露腹膜，腔使细胞悬浮，打开腹壁皮肤，暴露腹膜，提起腹膜中心，插入注射针头，吸出全部提起腹膜中心，插入注射针头，吸出全部细胞悬液，细胞悬液，500g 离心离心5min，用，用pH7.4，0.1molL 磷酸缓冲液洗涤磷酸缓冲液洗涤2-3 次，收集细次，收集细胞，用含胞，用含10小牛血清、小牛血清、100Uml 青霉素青霉素和链霉素及和链霉素及HAT 的的DMEM 培养液制成培养液制成106 细胞细胞ml 悬浮液，使用悬浮液，使用24 孔板时，每孔加孔板时，每孔加0.1ml，当使用，当使用96 孔板时，则制成孔板时，则制成2x105 细细胞胞ml 的悬浮液，每孔加的悬浮液，每孔加0.1m!，然后置，然后置37的的CO，培养箱中温育，备用。，培养箱中温育，备用。 58第三章 抗体制药 n亲本细胞准备：亲本细胞准备： 取对取对8氮鸟嘌呤抗性的氮鸟嘌呤抗性的Louc 大鼠非分泌型浆大鼠非分泌型浆细胞瘤细胞瘤IR983F 细胞，用常规方法制成细胞悬浮液，细胞，用常规方法制成细胞悬浮液，按按1.5x105 细胞细胞 ml 接种量接种于接种量接种于DMEM 培养液培养液中，于中，于37CO2 培养箱中培养至对数生长期，经培养箱中培养至对数生长期，经常规消化分散法用常规消化分散法用DMEM 培养液制成细胞悬浮液，培养液制成细胞悬浮液，即为待融合用骨髓瘤细胞亲本，备用。即为待融合用骨髓瘤细胞亲本，备用。 另取另取HBsAg 用用pH7.4，0.1molL 磷酸缓冲液溶解磷酸缓冲液溶解并稀释成并稀释成20gml 的溶液，加等体积福氏完全佐的溶液，加等体积福氏完全佐剂充分乳化后，取剂充分乳化后，取2ml 注入注入Louc 大鼠腹腔，大鼠腹腔，2 周后进行第周后进行第2 次免疫，次免疫，3 个月后于融合前个月后于融合前34 天天进行加强免疫进行加强免疫 。59第三章 抗体制药 于细胞融合前处死大鼠，用碘酒棉球及酒精棉球于细胞融合前处死大鼠，用碘酒棉球及酒精棉球先后对右上腹部消毒，剖开腹部，用无菌剪刀与先后对右上腹部消毒，剖开腹部，用无菌剪刀与镊子取出脾脏，用镊子取出脾脏，用pH7.4，0.1molL 磷酸缓冲液磷酸缓冲液洗去血液，在无菌烧杯或培养皿中切成洗去血液，在无菌烧杯或培养皿中切成1mm3 小小块，再用磷酸缓冲液洗涤块，再用磷酸缓冲液洗涤34 次，直至澄清，倾次，直至澄清，倾去洗涤液，加入组织块去洗涤液，加入组织块56 倍体积倍体积(质量体积质量体积)的的0.25%胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液(pH7.67.8)于于37 度保温，度保温，消化消化20 一一40min，每，每10min 轻摇消化瓶轻摇消化瓶1 次，直至次，直至组织块松软为止，倾去胰蛋白酶溶液，再用上述组织块松软为止，倾去胰蛋白酶溶液，再用上述磷酸缓冲液洗涤磷酸缓冲液洗涤35 次，然后加入少量磷酸缓冲次，然后加入少量磷酸缓冲液用液用10ml 吸管吹打分散，至大部分组织块分散为吸管吹打分散，至大部分组织块分散为细胞，用两层无菌纱布过滤，未分散的组织块再细胞，用两层无菌纱布过滤，未分散的组织块再加少量磷酸缓冲液吹打和分散，合并细胞滤液，加少量磷酸缓冲液吹打和分散，合并细胞滤液，离心收集细胞并用磷酸缓冲液洗涤离心收集细胞并用磷酸缓冲液洗涤23 次，然后次，然后用无血清的用无血清的DMEM 培养液稀释制成细胞悬浮液，培养液稀释制成细胞悬浮液，即为免疫大鼠脾淋巴细胞亲本，备用。即为免疫大鼠脾淋巴细胞亲本，备用。60第三章 抗体制药 n固定化抗大鼠固定化抗大鼠K 轻链单抗的制备：轻链单抗的制备： 载体也为载体也为SepharoseSepharose 4B 4B，其活化方法与制备固定化，其活化方法与制备固定化t-PA t-PA 相同。取相同。取30g 30g 活化的活化的SepharoseSepharose 4B 4B 悬浮于悬浮于100ml100ml，pH10.2pH10.2，0.025mol/L 0.025mol/L 硼酸缓冲液中，另取硼酸缓冲液中，另取1g 1g 抗大鼠抗大鼠K K 轻链的轻链的McAb(MARK-1)McAb(MARK-1)溶于溶于25ml 25ml 硼酸缓冲液，然后加至上述已活硼酸缓冲液，然后加至上述已活化的化的SepharoseSepharose 4B 4B 悬浮物中，于悬浮物中，于10 10 度搅拌反应度搅拌反应161620h20h，将其装柱，将其装柱( (直径直径2cm*50cm)2cm*50cm)并用并用10 10 倍柱床体积倍柱床体积( (体积体体积体积积) )的上述硼酸缓冲液以的上述硼酸缓冲液以5 56ml6mlmin min 流速洗涤柱床，收流速洗涤柱床，收集流出液，测集流出液，测A280 A280 并根据流出液计算偶联效率然后依并根据流出液计算偶联效率然后依次用次用5 5 倍柱床体积倍柱床体积( (体积体积体积体积) )的的pH10pH10，0.1mol/L 0.1mol/L 乙醇乙醇胺溶液及胺溶液及pH8.0pH8.0，0.1mol0.1molL L 硼酸缓冲液充分洗涤最后硼酸缓冲液充分洗涤最后用用pH7.4pH7.4，0.1mo/L 0.1mo/L 磷酸缓冲液洗至流出液磷酸缓冲液洗至流出液A280 A280 小于小于0.010.01，即得抗，即得抗HBsAgHBsAg McAbMcAb 的亲和吸附剂，将其转移至含的亲和吸附剂，将其转移至含0.01NNaN3 0.01NNaN3 的的pH7.4pH7.4，0.1mol 0.1mol 磷酸缓冲液中，于磷酸缓冲液中，于44贮存，贮存，备用。备用。61第三章 抗体制药 n细胞融合：细胞融合： 取取107 个个IR983 F 细胞与细胞与108 个免疫大鼠脾个免疫大鼠脾淋巴细胞于淋巴细胞于50mi 离心管中，混匀，在离心管中，混匀，在4 度度下，下，1500rmin 离心离心810min，用巴斯德，用巴斯德吸管小心吸去上清液，轻弹管底，使沉淀吸管小心吸去上清液，轻弹管底，使沉淀的细胞松动，于的细胞松动，于37 度水浴中保温，并于度水浴中保温，并于lmin 内轻轻滴加内轻轻滴加0.8ml 50%PEG4000，同时，同时用吸管尖轻轻搅动用吸管尖轻轻搅动6090s，然后于，然后于2min 内内缓慢滴加缓慢滴加20mlDMEM 培养液，培养液，1500rmin 离心离心810min，吸去上清液，然后再用含，吸去上清液，然后再用含20%小牛血清的小牛血清的DMEM 培养液稀释至培养液稀释至50ml，制成细胞悬浮液，得细胞融合混合物。，制成细胞悬浮液，得细胞融合混合物。 62第三章 抗体制药 n杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞筛选： 筛选产生抗筛选产生抗HBsAg 单抗的杂交瘤细胞的方单抗的杂交瘤细胞的方法是用法是用AUSAB 酶免疫试剂盒测定表达抗体酶免疫试剂盒测定表达抗体的细胞，即将包被了人的细胞，即将包被了人HBsAg 的聚苯乙烯的聚苯乙烯珠与待测杂交瘤培养上清培育，然后用磷珠与待测杂交瘤培养上清培育，然后用磷酸缓冲液洗涤酸缓冲液洗涤34 次，加入用生物素偶联次，加入用生物素偶联的的HBsAg 培育后洗涤，再加过氧化物酶标培育后洗涤，再加过氧化物酶标记的亲和素培育，最后用邻苯二胺记的亲和素培育，最后用邻苯二胺(OPD)显显色，经酶标仪定量测定，以确定产生抗色，经酶标仪定量测定，以确定产生抗HBsAg 单抗的阳性孔。单抗的阳性孔。 63第三章 抗体制药 n抗抗HBsAg 单克隆抗体的生产单克隆抗体的生产： 抗抗HBsAg 的单克隆抗体可采用人工生物反应器培的单克隆抗体可采用人工生物反应器培养杂交瘤细胞进行生产，也可采用动物体作为生养杂交瘤细胞进行生产，也可采用动物体作为生物反应器进行生产，后者又可通过诱发实体瘤及物反应器进行生产，后者又可通过诱发实体瘤及腹水瘤进行生产。腹水瘤进行生产。 叙述腹水瘤生产技术叙述腹水瘤生产技术：向健康的：向健康的Louc 大鼠腹腔大鼠腹腔注射注射1ml 降植烷降植烷(Pristane)，饲养，饲养19 周后，向周后，向大鼠腹腔接种大鼠腹腔接种5x106 个杂交瘤细胞，饲养个杂交瘤细胞，饲养911 天天后即可明显产生腹水，待腹水量达到最大限度而后即可明显产生腹水，待腹水量达到最大限度而大鼠又濒于死亡之前时，处死动物，用毛细管抽大鼠又濒于死亡之前时，处死动物，用毛细管抽取腹水，一般可得取腹水，一般可得50ml 左右。同时也可取其血清左右。同时也可取其血清分离抗体，此外也可不处死动物，而是每分离抗体，此外也可不处死动物，而是每13 天天抽取抽取1 次腹水，通常每一动物可抽取次腹水，通常每一动物可抽取10 次以上，次以上，从而获得更多单克隆抗体。从而获得更多单克隆抗体。 64第三章 抗体制药 n抗抗HBsAg 单抗的分离纯化：单抗的分离纯化： 将固定化抗大员将固定化抗大员K 轻链的轻链的Sepharose 4B 亲和吸附亲和吸附剂装柱剂装柱(直径直径4cmX20cm)。 用用5 倍柱床体积倍柱床体积(体积体积体积体积)的的9H7.4，0.1mol/L 磷酸缓冲液以磷酸缓冲液以23m1min 流速洗涤和流速洗涤和平衡柱床，然后将平衡柱床，然后将100ml 含抗含抗HBsAg 单抗的腹水单抗的腹水用生理盐水稀释用生理盐水稀释5 倍倍体积体积体积体积)，以，以2m1min 流速进柱，然后用流速进柱，然后用pH7.4，0.1mol/L 磷酸缓冲液洗磷酸缓冲液洗涤柱床，同时测定涤柱床，同时测定A280，等第一个杂蛋白峰洗出，等第一个杂蛋白峰洗出后，改用含后，改用含2.5molLNaCl 的上述磷酸缓冲液洗的上述磷酸缓冲液洗涤，除去非特异性吸附的杂蛋白，然后用涤，除去非特异性吸附的杂蛋白，然后用pH2.8 的甘氨酸的甘氨酸-HCl 缓冲液洗脱，同时分部收集洗脱液，缓冲液洗脱，同时分部收集洗脱液，合并含单抗的洗脱液，立即用合并含单抗的洗脱液，立即用pH8.0，0.1mol/LTris-HCl 缓冲液中和至缓冲液中和至pH7.0，经超滤，经超滤，浓缩及冻浓缩及冻 于后即得抗于后即得抗HBsAg 的单克隆抗体精品。的单克隆抗体精品。 65第三章 抗体制药