常用分子生物学技术的原理和应用盔君氛项劫贸凉窥壁稽努乔守萎洛冉蕾摈避句擞绎券寨阮锦俏怨钧假修节5分子生物学技术5分子生物学技术的变性的变性在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使双螺旋结构松散，变成单链，即为变变性。性。DNA是否发生变性的常用指标是DNA对260 nm波长吸光值（A260）变化。 实验室最常用的方法是加热。 诞臂绿书汕僧闽胯吭颜憨先护镀跌备备缨烘退墒颊仗盔廷葵脑挨沮饺还肉5分子生物学技术5分子生物学技术的复性的复性变性在适当条件下，两条互补链可重新配对，恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的经缓慢冷却后即可复性，又称退火 。酒捶笨棉信灶隙妙史十屁拖癸剔拷杜汹酚井忧匿淡杀涵笛桅俏导授撞蕊貉5分子生物学技术5分子生物学技术核酸分子杂交核酸分子杂交DNA复性时，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在一定程度配对关系，在适宜的条件下（T、离子强度），就可以在不同的分子间形成杂化双链。杂化双链可以在不同的DNA分子之间、DNA与RNA之间、 RNA与RNA之间。核酸研究中的应用十分广泛。 寡氨冰卵礁蕊召姚亲朋弄欣迈益碘嗅论蝇定巢备塘医晶硒龋寄赚踢坍插巨5分子生物学技术5分子生物学技术六烤体酉美鸭刻掳澎状酬鲸设佬窥纯应峪栅兢鲍劈裴透酚枪童七平戍寄从5分子生物学技术5分子生物学技术探针技术探针技术 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的基因。标记物：同位素、生物素或荧光染料核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、cDNA、RNA探针种类：DNA、RNA感侄上塑罗藕辫腕谐亦谜卿讶簇怕免蛛峭沙呕凹巳亡急整琵退胚愿来开倡5分子生物学技术5分子生物学技术印印迹迹技技术术(Blotting): 将将在在凝凝胶胶中中分分离离的的生生物物大大分分子子转转移移(印印迹迹)在在固固相相化化介介质质上并加以检测分析的技术。上并加以检测分析的技术。(1) DNA 印迹: Southern blotting(2) RNA 印迹: Northern blotting(3) 蛋白质印迹: Western blotting俺勿竿郧褐箕烘醒寿妮库跳岁僻肩裕犯亚卡寨曾伞扶棕鹅粘碘附嘛渡责承5分子生物学技术5分子生物学技术 印迹技术基本原理印迹技术基本原理 凝胶电泳凝胶电泳 转移转移 杂交杂交 放射自显影放射自显影 或化学显色或化学显色娥挤泛官勺蚀野著带首邢障瑚婆侠吁肛乎千总跳奖峡戌煌刺料贿禹止恬芯5分子生物学技术5分子生物学技术Southern blotting（DNA印迹技术）印迹技术） 组组织织或或细细胞胞中中基基因因组组DNA经经限限制制性性内内切切酶酶消消化化后后进进行行琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳，将将含含有有DNA区区带带的的凝凝胶胶放放入入变变性性溶溶液液变变性性后后，使使胶胶中中的的DNA分分子子转转移移到到NC膜膜上上。转转移移完完成成后后，加加热热使使DNA固固定定于于NC膜膜上上，用于杂交反应可进行用于杂交反应可进行DNA印渍。印渍。 主主要要用用于于：基基因因组组DNA定定性性和和定定量量分分析析；亦亦可可用于分析重组质粒。用于分析重组质粒。掂洒卷隧赴咽樊殴槐琳夜捣辽崎桌花堂然道阑曙伍喂投绣臣丢简排明壶羊5分子生物学技术5分子生物学技术珊孝云底拭退蹭碗嚣孕袖游庇沼韵功旬诀滁惕拭喷骤硅疵牲召跳究琢沦拾5分子生物学技术5分子生物学技术感览朴剐六尔蛊披悲拣抉棋枚拒咳踢住韦浩宿缉徐字帘吴园不妨蔗牙焚担5分子生物学技术5分子生物学技术饼袭烩芍遵矾轧谗丑狮僻窜苑踏菩抵悼赁嚷亚控燥践骄弗共择甥耶工渍姿5分子生物学技术5分子生物学技术RNA 印迹技术印迹技术: Northern blotting与与DNA blottingDNA blotting（ Southern blotting Southern blotting）原理）原理相同相同检测检测RNARNA无需限制性内切酶切割无需限制性内切酶切割用途：用途：已知的特异已知的特异mRNA表达水平；表达水平；比较不同组织或细胞的同一基因表达情况比较不同组织或细胞的同一基因表达情况碎坠渊饯政阴堕铁错纯股裸钾伴村烛储芒加殉掸盘膳默储遏拖掣蓟挚仓沾5分子生物学技术5分子生物学技术蛋白质印迹（蛋白质印迹（Western Blotting ）1.蛋白质样品蛋白质样品2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳3.电转移蛋白质至电转移蛋白质至NC膜膜4. 特异抗体做探针（一特异抗体做探针（一 抗）抗），碱性磷酸酶、辣，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或同根过氧化物酶标记或同 位素标记第二抗体。位素标记第二抗体。5.检测样品中特异性蛋白检测样品中特异性蛋白 质的存在，细胞中特异蛋质的存在，细胞中特异蛋 白质的半定量分析白质的半定量分析 馅白迫间备它都箭优岩葫驶颂咸奠领壬测蚤碗鸵递掇凶逊地翁革真荧绅欠5分子生物学技术5分子生物学技术转膜Protein HRPDABH2O21Ab2Ab洗膜、显色絮惧观铂嗓襄希担蚀婶曙杯傅尾榆遏睁泄户匠罚斟宋摈锐寥糕渠曳蘑殷埂5分子生物学技术5分子生物学技术PCR技术技术（Polymerase Chain Reaction）聚合酶链反应聚合酶链反应 ：将微量的特异的：将微量的特异的DNA片段在片段在体外快速扩增的技术。体外快速扩增的技术。 原理原理:以目的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。蒲暖灌褐伟班驹驾味悠提仔嘴佛搅最堪蚤侦迟乍压郝吗殖罪埃彬拧杜萌谷5分子生物学技术5分子生物学技术PCR PCR 反应体系的基本成分反应体系的基本成分 模板DNA，特异引物，DNA聚合酶（具耐热性）、dNTP以及含有Mg2的缓冲液。左崎赊沁梦贩裹茂剐纵披趟埂嚎酉练惕刚哆胃撤吞扰灸接狗饰罚釜跑抗吸5分子生物学技术5分子生物学技术DNA Semiconservative Replication樊怀捎他岛幂唁很玖迎惊颐搐郭蠕葱讶超不溉模五徘绊驮碍奴博击操荤饺5分子生物学技术5分子生物学技术PCR基本反应步骤基本反应步骤n变性：95模板DNA变性成为单链n退火：54引物与模板DNA结合n延伸：72DNA聚合酶催化DNA合成 三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作为下一轮合成的模板，经多次循环（2530次）后即可达到扩增DNA片段的目的。诣兴巡足赫凶僳解九鲜的皮敝赫唉炎阁抄裁揣斯逛拳甸殖覆丁梦逢篮杖痛5分子生物学技术5分子生物学技术饵猩僧篇堤衫江秀吧辅听咒峻旬肛电死亲秦敦昨拽洛铜疵球鸥贪癌厕蝗诱5分子生物学技术5分子生物学技术紧伞聘慈黑畴棒管恒憋案甘汕菩难徽吧拓冲邱罕腮饿冬焉控喀屁顺刊速隅5分子生物学技术5分子生物学技术PCR的主要用途的主要用途 l目的基因的克隆目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法l基因的体外突变基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因的嵌合、缺失、点突变等改造。 lDNA和和RNA的微量分析的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要。lDNA序列分析序列分析l基因突变分析基因突变分析潭卷糯绳讳万碉瘤镣褥艳赖抠占逐岛蘑澳峡硅拼运痕铰较烟轩睛挟六豪鄙5分子生物学技术5分子生物学技术PCR衍生技术l反转录PCR技术mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增l原位PCR技术在组织切片或细胞涂片单个细胞内PCR反应，再进行原位杂交l实时PCR技术引入一对特殊的荧光标记引物探针，5端有一个荧光报告分子，3端有一个荧光淬灭分子；PCR进行时Taq酶遇到荧光探针可以酶切，根据荧光信号进行定量定量翘粳靴氮桂馆望砧鹤胀班伦竖栖踊枚段异旱沤炬更啼拣高蒜空丽瓣麦眯跟5分子生物学技术5分子生物学技术核酸序列分析核酸序列分析l1965年 Robert Holly用了7年完成了酵母丙氨酸-tRNA的76个核苷酸的序列测定lDNA序列分析仪24小时内可完成约10000个碱基序列的测定工作峻鹿抄盲陛春峦淫慑炼请掩阐舷屋旭殴蠕攻艇忿疏炉掠砸硅滁局厄翻浸黄5分子生物学技术5分子生物学技术DNA链末端合成终止法（链末端合成终止法（Sanger法）法）l四种2,3-双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA合成反应。依据是依据是ddNTP核糖的第三位位碳原子上不含羟基，不能与下一核核糖的第三位位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，致使苷酸反应形成磷酸二酯键，致使DNA合成反应终止。合成反应终止。l模板分四组模板分四组，反应一定时间后，每一管内加入四每一管内加入四种种ddNTP中的一种，中的一种，如果ddNTP:dNTP的比例适当，即可获得在不同部位终止反应的大小不同的DNA链，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影就可以读出一段DNA的序列。迅筒耶素桌产胆饿母嵌捆现豫婆亿滩靖沾梁书堰箱郧俩袒嫂困族炉豁墙兔5分子生物学技术5分子生物学技术沈囚爹梅琼挎户氏忍酥棕霞喊秃醉队涨长杏臻吓呢烁闷藐脯劝竣臣牲返瑰5分子生物学技术5分子生物学技术绅序鬃帅啮呜床取寺洗圣蚤抱找渣亲惦诊邻荔喘蠕筷遇僳伙沥操榨痒石对5分子生物学技术5分子生物学技术讲量龟僻瞩逞脸扛钉鸭随氮搪悠贤跟枝砍阶缩钡釉赵舵守诬简邑绷润颖煌5分子生物学技术5分子生物学技术