张少敏03081028Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法,双缩脲法( Biuret法) Folin -酚试剂法( Lowry 法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法( Bradford法).其中Bradford 法和 Lowry 法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比 Biuret 法高100倍以上.凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质.n下面只简单介绍凯氏定氮法和考马斯亮蓝法n一.微量凯氏定氮法n 样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨,氨又与硫酸作用变成硫氨.经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液 被中和的程度可计算得样品氮的含量.以甘氨酸为例:H2NCH2COOH +3H2SO4 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (l) (1)2NH3 +H2SO4 (NH4)2SO4 (2) (NH4)SO4 +2NaOH 2H2O+Na2SO4 +2NH3 (3)此法灵敏度低,适用于0.2-1.0mg 氮,误差为2%,费时8-10小时,将氮转化为氨,用酸吸收后滴定 .n二. 考马斯亮蓝法n1).原理n1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法之一.n考马斯亮蓝G-20染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合.n在595nm下测定的吸光度A595,与蛋白质浓度成正比.n Bradford 法的突出特点:n(1)灵敏度高.其最低检测蛋白质含量可达1mg,这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的吸光系数,因而光吸收要比Folin 酚试剂法大得多.n(2)测定快速,简洁,只需要加一种试剂.完成一个样品的测定,只要5分钟左右 .由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.n(3).干扰物质少.zzzzzz此法缺点:(1).由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差 .(2).仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有去污剂等(3).标准曲线也有轻微的非线形,因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.n(二) 试剂与器材n1.试剂:n(1)标准蛋白质溶液,用G-蛋白或牛血清蛋白( ) ,配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液.n(2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250,溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml85 %的磷酸,用水稀释至1Ln2.器材n(1)可见光分光光度计n(2)旋涡混合器n(3)试管16支n(三)操作方法n1标准方法n(1)取16支试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分为两组,按表中顺序,分别加入样品,水和试剂,即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给个试管分别加入:0,0.01,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1ml,然后用水补充到0.1ml最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂.未知样品见表中的8, 9,10管n(2)加完试剂2-5分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595,空白对照为1号管.注意:不可用石英比色皿(因不易洗去染料)(3)用标准蛋白质(mg)为横坐标,用吸光值A595为纵坐标,作图 ,即得一标准曲线.由此标准曲线,根据测出的为止样品A595值,即可查出样品蛋白质含量.0.50mg牛血清蛋白/ml溶液约为0.50.管号管号 12345678910蛋白质蛋白质（mg/ml） 00.010.020.040.060.080.100.020.040.06蒸馏水蒸馏水 0.10.090.080.060.040.020.000.080.060.04考马斯考马斯亮兰亮兰5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0n2.微量法当样品中蛋白质浓度较稀时(10-100mg/ml)可将取样(包含补加的水)加到0.5ml或1.0ml,空白对照则分别为0.1ml或1.0mlH2O,考马斯亮兰G-250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线,测595nm的光吸收值. 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液A595约为0.29nz