流式细胞仪分析技术流式细胞仪分析技术 流式细胞术流式细胞术(flow cytometry, FCM)是是2020世纪世纪7070年代发展起来的一种以流式细胞仪为年代发展起来的一种以流式细胞仪为工具，能快速测量细胞的物理或化学性质，工具，能快速测量细胞的物理或化学性质，如大小、内部结构、如大小、内部结构、DNADNA、RNARNA、蛋白质、抗、蛋白质、抗原等，并可对其分类、收集的高新技术。原等，并可对其分类、收集的高新技术。概述概述 流式细胞术（FCM）借鉴了荧光显微镜技术, 同时利用计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多门高新技术的发展, 将荧光显微镜的激发光源改为激光, 使之具有更好的单色性与激发效率, 因而大大提高了检测灵敏度, 同时将固定的标本台改为流动的单细胞悬液, 用计算机进行数据处理, 从而大大提高了检测速度与统计精确性, 而且从同一个细胞中可以同时测得多项参数, 被誉为是细胞分析领域的“CT”。 流式细胞术（FCM）以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等，在各学科领域发挥着重要的作用。第一部分第一部分 流式细胞仪的分析及分选原流式细胞仪的分析及分选原理理第二部分第二部分 数据的显示与分析数据的显示与分析第三部分第三部分 流式细胞仪免疫分析的技术流式细胞仪免疫分析的技术要求要求第四部分第四部分 流式细胞术在免疫学检查中流式细胞术在免疫学检查中的应用的应用第五部分第五部分 应用举例应用举例 流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技术、空气技术、射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。 第一部分第一部分 流式细胞仪的分析流式细胞仪的分析及分选原理及分选原理 该仪器具有高度的精密性，测定的数据准确可靠。既可分析单个细胞，也能区分群体细胞，检测的速度可达5000个细胞/秒，分选纯度可高达99%以上。 由于该仪器的多参数性、准确性、快速性及分选的高纯度性等特点，所以在细胞生物学、免疫学、肿瘤学、病理学及临床医学等领域中得到越来越广泛的应用。 细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞表面细胞表面/ /胞浆胞浆/ /核核-特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA, RNADNA, RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子, PH, PH值值, , 膜电位膜电位 酶活性酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性流式细胞仪常检测的细胞特性 经荧光色素染色的细胞或包裹在鞘液里的其经荧光色素染色的细胞或包裹在鞘液里的其他生物微粒，从他生物微粒，从5050100100mm的喷嘴逐个高速喷的喷嘴逐个高速喷出，通过一个聚焦的光源，进而通过各种光敏出，通过一个聚焦的光源，进而通过各种光敏元件测量这些细胞或微粒所发射的散射光以及元件测量这些细胞或微粒所发射的散射光以及荧光，经计算机分析和处理可得到多种信息参荧光，经计算机分析和处理可得到多种信息参数。数。一、工作原理一、工作原理 结构示意图结构示意图单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本过程基本过程 （1 1） 液流系统液流系统 （2 2） 光学系统光学系统 （3 3） 数据处理系统数据处理系统1.流式细胞仪的基本结构：流式细胞仪的基本结构：由样本和鞘液组成由样本和鞘液组成待测细胞待测细胞 单个细胞的悬液单个细胞的悬液 荧光染料标记的荧光染料标记的单抗对其染色单抗对其染色 受清洁气体压力受清洁气体压力 从样品管进从样品管进入流动室形成样本流入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。（1）液流系统）液流系统喷嘴喷嘴FluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeam鞘液鞘液液流系统示意图液流系统示意图FCMFCM的液流系统（如的液流系统（如何形成单个细胞流）何形成单个细胞流）样本管样本管鞘液管鞘液管激光光源：气冷式氩离子激光器激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长分色反光镜：反射长/ /短波长，通过短短波长，通过短/ /长长波长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通滤片：长通、短通、带通光电倍增管：光电倍增管：FS, SSFS, SS（散射光），（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）（荧光）（2）光学系统）光学系统FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光学系统示意图光学系统示意图主要由计算机及其软件组成主要由计算机及其软件组成（3）数据处理系统）数据处理系统 细胞在液柱中与激光束相交时细胞在液柱中与激光束相交时向周围向周围360立体角方向散射的光线立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分状、胞内颗粒折射等有关，主要分为为前向散射光前向散射光和侧向散射光侧向散射光。二、散射光的测定二、散射光的测定前向散射光前向散射光（forward scatter, forward scatter, FSFS）：激光束照射细胞时，光激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度以相对轴较小角度(0.5(0.51010) )向前方散射的讯号用于检测细向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。FALS SensorLaser前向散射光示意图前向散射光示意图侧向散射光（侧向散射光（side scatter, SSside scatter, SS）：）：激光束照射细激光束照射细胞时，光以胞时，光以9090角散射的讯号，用于检测细胞角散射的讯号，用于检测细胞内部内部结构属性。结构属性。FALS Sensor90LS SensorLaser侧向散射光侧向散射光示意图示意图 测得的测得的FSFS与与SSSS信信号通过计算机处理，号通过计算机处理，可得到可得到FS-SSFS-SS图，由图，由此可仅用散射光信号此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进对未染色的活细胞进行分析或分选。行分析或分选。 此为血细胞分类此为血细胞分类的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。多个不同特征。线性放大器和对数放大器线性放大器和对数放大器三、荧光测量三、荧光测量荧光染料的特性荧光染料的特性激发波长激发波长(EXCITING)(EXCITING)发射波长发射波长(EMISSION)(EMISSION)荧光补偿荧光补偿 通过流式细胞仪进行细胞分选通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。进一步培养和研究时进行的。四、细胞分选原理四、细胞分选原理细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电（一）分选基本原理（一）分选基本原理分选速度：分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。的百分率。分选收获率：分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。与分选速度成反比。（二）分选的技术要求（二）分选的技术要求参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FL数据显示方式数据显示方式 （单参数直方图（单参数直方图 、双、双参数散点图参数散点图 、二维等高图、二维等高图 、假三维、假三维等高图等高图 、三参数散点图、三参数散点图 ）设门分析技术设门分析技术 第二部分第二部分 数据的显示与分析数据的显示与分析FSFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少一、一、 参数参数单参数直方图单参数直方图双参数直方图双参数直方图: :点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图三参数直方图三参数直方图多参数分析多参数分析直分析方图直分析方图设门分析设门分析: :REGION和和GATE设置设置二、数据显示方式二、数据显示方式 由一维参数由一维参数( (散射光或荧光散射光或荧光) )与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图（一）单参数直方图单参数直方图单参数直方图细细胞胞相相对对数数量量信道信道(channel(channel ) )双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。强度的颗粒数量的多少。（二）双参数直方图（二）双参数直方图1.双参数直方图点图双参数直方图点图绿色荧光强度绿色荧光强度红红色色荧荧光光强强度度双参数直方图点图双参数直方图点图2. 二维等高图二维等高图由类似地图上的等高线组成，其本质也是由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即胞相对或绝对数，即“等高等高”。曲线层次越高曲线层次越高( (越里面的线越里面的线) ) 所代表的细胞所代表的细胞数愈多。数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。二维等高图二维等高图3. 假三维等高图假三维等高图（三）三参数直方图（三）三参数直方图 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。号可根据需要进行组合分析。（四）流式细胞仪的多参数分析（四）流式细胞仪的多参数分析 Gate Gate设置：指在某一张选定参数的直设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。形门、多边形门、任意形状门和十字门。 三、设门分析技术三、设门分析技术A A 淋巴细胞淋巴细胞B B 单核细胞单核细胞C C 中性粒细胞中性粒细胞A A、B B、C C均均为任意门为任意门线性门线性门Region设置设置: 区阈（区阈（region, R）与门）与门(gate, G ) 是两个是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。可以包含于门。D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字门分析时，起如十字门分析时，起就可以由四个区域构就可以由四个区域构成，即成，即G=D1+D2+D3+D4。 样本制备样本制备标记染色标记染色液相芯片技术液相芯片技术 质量控制质量控制 第三部分第三部分 流式细胞仪免疫分析的技术要流式细胞仪免疫分析的技术要求求 外周血淋巴细胞样品的制备外周血淋巴细胞样品的制备分离单个核细胞分离单个核细胞培养细胞的样品制备培养细胞的样品制备 蛋白酶消化蛋白酶消化 机械吹打机械吹打 使贴壁细胞脱落使贴壁细胞脱落 洗涤洗涤 尼龙网过滤尼龙网过滤单细胞悬液单细胞悬液一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备机械法机械法酶处理法酶处理法化学试剂处理法化学试剂处理法表面活性剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存单细胞悬液的保存深低温保存法（一年）深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周）甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）适用条件适用条件: :有较高的量子产额和消光系数有较高的量子产额和消光系数对对488nm488nm的激发光波长有较强的吸收的激发光波长有较强的吸收发射光波长与激发光波长间有较大的波长差发射光波长与激发光波长间有较大的波长差易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性二、常用的荧光染料与标记染色二、常用的荧光染料与标记染色FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光细细胞胞悬悬液液异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素得州红得州红能量传递复合染料能量传递复合染料藻胆蛋白类藻胆蛋白类（一）几种常见的荧光染料（一）几种常见的荧光染料名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITCFITC488488绿绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性得州红得州红Texas Texas redred568568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低藻红蛋白藻红蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋白别藻青蛋白APCAPC633633红红670670能量传递复能量传递复合染料合染料PEcy5PEcy5488488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高常用的几类荧光染料常用的几类荧光染料 用化学法将两种不同激发波长的染料用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在结合在一起，在488nm488nm激发光照射下，通过激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。测到该特定荧光信号。能量传递复合染料能量传递复合染料PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷花青苷5 5藻红蛋白藻红蛋白能量传递复合染料机制能量传递复合染料机制荧光染料与细胞成分的四种结合方式荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式结构亲和式嵌入结合嵌入结合共价键结合共价键结合荧光标记抗体特异性结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法免疫荧光标记方法直标直标: :干扰少干扰少, ,但需购买多种单抗但需购买多种单抗间标间标: :步骤多步骤多, ,干扰多干扰多, ,不需标记多种抗体不需标记多种抗体组合标记组合标记（二）免疫荧光标记（二）免疫荧光标记免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待测针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待测标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测物产生不同颜色，并可进激光照射后不同待测物产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液液相芯片相芯片”之称之称 。三、免疫胶乳颗粒技术的应用三、免疫胶乳颗粒技术的应用微小的乳胶微球分别染成上百微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）片则是用颜色来编码）通过对标记不同荧光素分子的检测，实通过对标记不同荧光素分子的检测，实现现FCMFCM对可溶性物质的定量分析对可溶性物质的定量分析适当的制备方式适当的制备方式处理红细胞处理红细胞实体组织来源标本用机械法实体组织来源标本用机械法温度温度25253737，pH7.0pH7.07.27.2四、流式细胞免疫学技术的质量控制四、流式细胞免疫学技术的质量控制（一）单细胞悬液制备的质控（一）单细胞悬液制备的质控温度温度pHpH染料浓度染料浓度固定剂固定剂（二）免疫荧光染色的质控（二）免疫荧光染色的质控光路与流路校正光路与流路校正: : 确保激光光路与样品确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（流处于正交状态，减少变异（CVCV）。）。PMTPMT（光电倍增管）校准（光电倍增管）校准: : 保证样品检测保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准绝对计数校准: : 保证计数的准确性。保证计数的准确性。Flow-checkFlow-checkFlow-checkFlow-checkFlow-setFlow-setFlow-setFlow-setFlow-countFlow-countFlow-countFlow-count（三）仪器操作的质控（三）仪器操作的质控同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的选用相同源性的未标记单抗未标记单抗作为对照调整和作为对照调整和设置电压，以保证特异性。设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。结果达靶值，提示本次实验结果可靠。（四）免疫检测的质控（四）免疫检测的质控 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。加了有效的手段和帮助。 第四部分第四部分 流式细胞术在免疫学检验流式细胞术在免疫学检验中的应用中的应用T T淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生产生IgM型自身抗体型自身抗体, 参与免疫调节、与自参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关身免疫病的发生有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴细胞及其亚群的分析一、淋巴细胞及其亚群的分析细胞介导细胞毒性试验细胞介导细胞毒性试验( (死细胞与活细胞比例死细胞与活细胞比例) )细胞内细胞因子测定细胞内细胞因子测定二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析三、淋巴造血系统及白血病免疫分型三、淋巴造血系统及白血病免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型用于选择化疗方案、判断预后及检出微小用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变残留病变CD4+Th细胞、细胞、CD4+/CD8+比例比例MDR(+)表示对化疗药物耐药表示对化疗药物耐药四、肿瘤耐药基因分析四、肿瘤耐药基因分析五、五、AIDS病检测中的应用病检测中的应用HLA-B27可出现在可出现在58%97%的强直的强直性脊椎炎性脊椎炎(As) 患者患者六、自身免疫病相关六、自身免疫病相关HLA抗原分析抗原分析 FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式应用主要包括流式细胞术的交叉配型（细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。）检测。七、移植免疫中的应用七、移植免疫中的应用小小 结结流式细胞术（流式细胞术（FCM）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构）是在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号实现对单个细胞进行定量分析或纯化分选。对单个细胞进行定量分析或纯化分选。FCM分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反映分析中前向散射光反映颗粒的大小；侧向散射光反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度；荧光反映颗粒被染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即染上荧光部分数量的多少，根据其标记的抗原分子不同，即反映了不同抗原分子的表达情况。反映了不同抗原分子的表达情况。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照，可使荧光标记单抗的信号保持其特异性。抗的信号保持其特异性。对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化对各项工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，是保证操作，是保证FCM分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。分析中各项检测数据和指标可靠性的关键。 以北京宝赛生生物技术有限公司生产以北京宝赛生生物技术有限公司生产的的Annexin-v-FITC凋亡检测试剂盒为例，凋亡检测试剂盒为例，介绍一种介绍一种Annexin-v-FITC和和PI双标记流双标记流式细胞检测法。式细胞检测法。第五部分、应用举例第五部分、应用举例 膜联蛋白膜联蛋白V(AnnexinV(Annexin-V)-V) 一种分子量一种分子量为为35-36KD的的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（到膜外的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）高亲和力特异性结合。高亲和力特异性结合。 碘化丙啶（碘化丙啶（propidium iodide, PI)是一种核酸染料，是一种核酸染料，将将Annexin-V与与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。和晚期的细胞以及死细胞区分开来。 以荧光素以荧光素FITC标记了的标记了的Annexin-V作为荧光探针，作为荧光探针，利用流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。利用流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。一、概述一、概述（1 1）Annexin-v-FITCAnnexin-v-FITC凋亡检测试剂盒：包括凋亡检测试剂盒：包括AnnexinAnnexin V- V-FITC(20FITC(20g/ml) g/ml) ，结合缓冲液，碘化丙啶，结合缓冲液，碘化丙啶(50(50g/mlg/ml），），4 4保存。保存。（2）流式细胞仪）流式细胞仪二、用品二、用品（1 1）调整待测细胞的密度为）调整待测细胞的密度为5 51051051 1106106个个/ml/ml。（2 2）取）取1ml1ml细胞，细胞，1000rpm 41000rpm 4离心离心10min，弃上清液。，弃上清液。（3）加入）加入1ml冷的冷的PBS，轻轻震荡，使细胞悬浮。，轻轻震荡，使细胞悬浮。（4 4）1000rpm 41000rpm 4离心离心10min，弃上清液。，弃上清液。（5）重复步骤）重复步骤(3)(4)两次。两次。（6）对于贴壁细胞，先用）对于贴壁细胞，先用0.25%胰蛋白酶消化，制成单个细胞悬液，再用胰蛋白酶消化，制成单个细胞悬液，再用PBS离心洗离心洗涤。涤。（7 7）将细胞重新悬浮于）将细胞重新悬浮于200l200l结合缓冲液。结合缓冲液。（8 8） 加入加入10lAnnexin V-FITC10lAnnexin V-FITC和和50l50l的的PIPI，轻轻混匀，避光室温反应，轻轻混匀，避光室温反应15min15min或或4 4反应反应30min。（9 9）加入）加入300l300l结合缓冲液，立即上机（流式细胞仪）检测，光源为结合缓冲液，立即上机（流式细胞仪）检测，光源为488nm488nm氩离子激氩离子激光器，光器，FITCFITC受激发后发绿色荧光，受激发后发绿色荧光，PIPI发红色荧光。发红色荧光。三、步骤三、步骤 流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图（方图（cytogramcytogram），每个象限的细胞数目就是在检测），每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数所在点的组分。细胞总数所在点的组分。 左下象限代表正常细胞（左下象限代表正常细胞（An-PI-An-PI-），右下象限代），右下象限代表早期凋亡细胞（表早期凋亡细胞（An+PIAn+PI-)-)，右上象限代表晚期凋亡细，右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（胞和坏死细胞（An+PIAn+PI+ +），左上象限代表细胞收集过），左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（程中出现的损伤细胞（An-PI+An-PI+）。）。四、结果分析四、结果分析