成才之路成才之路 生物生物路漫漫其修远兮路漫漫其修远兮 吾将上下而求索吾将上下而求索人教版人教版 选修选修1 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术专题五专题五课题课题2多聚酶链式反应多聚酶链式反应扩增扩增DNA片段片段专题五专题五课课 堂堂 合合 作作 探探 究究2思思 维维 创创 新新 升升 华华3知知 识识 体体 系系 构构 建建4课课 时时 作作 业业5课课 前前 预预 习习 导导 学学1课课 前前 预预 习习 导导 学学1.理解PCR的原理和反应过程。(重、难点)2尝试PCR技术的基本操作。3说出PCR技术的应用。一、PCR扩增的原理及条件1概念：PCR即_，是一种_迅速_的技术。它能以极少量的_为模板，在短时间内复制出上百万份的_。体外体外扩增扩增DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应拷贝拷贝2原理(1)DNA的热变性：在_的温度范围内，DNA_结构解体，_分开，这个过程称为_。当温度缓慢_后，两条彼此_的DNA链又会重新结合成_。(2)子链的合成：需要_；合成方向总是从子链的_。80100 双螺旋结构双螺旋结构双链双链变性变性降低降低分离分离双链双链DNA聚合酶聚合酶5端到端到3端端3条件(1)_模板。(2)分别与模板DNA相结合的两种_。(3)A、T、G、C四种_。(4)_DNA聚合酶。(5)需要稳定的_和能严格控制_的温控设备。DNA引物引物脱氧核苷酸脱氧核苷酸耐热的耐热的缓冲液缓冲液温度温度二、PCR反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为_、_和_三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与_结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于_之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈_扩增。变性变性复性复性延伸延伸引物引物两个引物两个引物指数指数DNA分子能准确复制的原因是什么？DNA分子独特的双螺旋结构为复制提供了精确的模板，通过碱基互补配对，保证了复制能够准确地进行。课课 堂堂 合合 作作 探探 究究一、PCR反应与体内DNA复制的比较PCR扩增反应与体内扩增反应与体内DNA复制的比较复制的比较 体内体内DNA复制复制PCR反应反应不不同同点点解旋解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开部分解开加热至加热至95左右，双链全部左右，双链全部解开，不需要解旋酶解开，不需要解旋酶引物引物一小段一小段RNA可以是可以是RNA或单链或单链DNA分子分子片段片段合成合成子链子链在引物基础上，一条链连续合成，在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度都是连续合成，控制温度72体内体内DNA复制复制PCR反应反应不不同同点点特点特点边解旋边复制，半保留复边解旋边复制，半保留复制制体外迅速扩增体外迅速扩增TaqDNA聚合酶聚合酶不需要不需要需要需要循环循环次数次数受生物体自身控制受生物体自身控制30多次多次温度温度体内温和条件体内温和条件高温高温(可变可变)相同点相同点需提供需提供DNA复制的模板复制的模板四种脱氧核苷酸为原料四种脱氧核苷酸为原料都需要一定的缓冲溶液都需要一定的缓冲溶液子链延伸的方向都是从子链延伸的方向都是从5端到端到3端端二、PCR的反应过程1变性当温度上升到90以上时，双链DNA解聚为单链。2复性温度下降到50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。3延伸温度上升到72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。如下图所示： PCR过程与细胞内DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是()PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNAPCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中，DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制ABC D导学号导学号 06350395解析PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为2030个核苷酸。(2)PCR过程中，DNA解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。答案为C答案C下列操作过程的叙述中错误的是()APCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20储存CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换答案C导学号导学号 06350396解析为了防止外源DNA等因素的污染，PCR反应中所用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水等，在使用前要进行高压灭菌；还要将所用的缓冲液和酶分装成小份；并且使用一次性吸液枪头，故A、B、D项都正确。在使用前，将PCR所需试剂从冰箱内拿出来，放在冰块上缓慢融化，则C项错误。答案为C。(1)理论上DNA呈指数方式扩增。若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后有2n个；若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N02n个。(2)DNA含量的测定：DNA在260nn的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：PCR扩增的计算与扩增的计算与DNA含量的测定含量的测定 温馨提示：PCR扩增过程中的易错点PCR过程中无解旋酶，破坏氢键需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键，因此，热变性后是DNA单链，并未分解成单体。复性时只是在引物和DNA单链之间形成氢键，两条单链之间并未形成氢键，因此复性后，无双链DNA分子形成。多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列问题：(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将_的末端称为5端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的_开始延伸DNA链。(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到_，它的发现和应用解决了上述问题；要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫_。 导学号导学号 06350397(3)PCR的每次循环可以分为三步：_。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有_个这样的DNA片段。(4)简述PCR技术的主要应用。_(要求3项以上)。 解析(1)DNA聚合酶作用时必须要有一个引物，它只能把新的核苷酸加到已经存在的核酸的3羟基上，与DNA母链结合的RNA引物就提供这个羟基。(2)因PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，所以用于催化DNA复制过程的DNA聚合酶要具有耐高温的特性。用选择培养基可将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来。(3)DNA复制的两条链均作为模板，进行半保留复制，所以复制5次后得到的子代DNA分子数为2532个。(4)PCR技术可以对DNA分子进行扩增，所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。 答案(1)磷酸基团3端(2)耐高温的TaqDNA聚合酶选择培养基(3)变性、复性和延伸32(4)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()A92、50、72 B72、50、92C50、92、72 D80、50、72答案A导学号导学号 06350398解析当温度上升到90(9096)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50(4060)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72(7075)时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。思思 维维 创创 新新 升升 华华实验操作的注意事项1PCR所用的缓冲液实验前应分装成小份，并在20储存。使用前，将缓冲液从冰箱中取出，放在冰块上缓慢融化，备用。2PCR所用的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。3为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸液枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。4在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。5PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。6PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。特别提示：PCR扩增过程中要进行无菌操作，避免污染。在操作中离心约10s，目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果。知知 识识 体体 系系 构构 建建答案变性复性延伸呈指数扩增