革兰氏染色及镜检革兰氏染色及镜检操作规范培训操作规范培训质量管理部质量管理部1革兰氏染色及镜检操作规范培训目录目录一、革兰氏染色法一、革兰氏染色法二、革兰氏染色原理二、革兰氏染色原理三、仪器设备、试剂三、仪器设备、试剂四、操作方法四、操作方法五、镜检及结果判定五、镜检及结果判定六、革兰氏染色图片六、革兰氏染色图片七、革兰氏染色注意事项七、革兰氏染色注意事项八、革兰氏染色小结八、革兰氏染色小结2革兰氏染色及镜检操作规范培训一、革兰氏染色法一、革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，别染色法，1884年由丹麦医师年由丹麦医师Gram创立。创立。3革兰氏染色及镜检操作规范培训细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，革兰氏阳性菌（后，用酒精脱色，革兰氏阳性菌（G+）不）不被脱去，革兰氏阴性菌（被脱去，革兰氏阴性菌（G-）可被脱去。）可被脱去。为为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。则被染上红色。4革兰氏染色及镜检操作规范培训有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现阴性反应。都呈现阴性反应。5革兰氏染色及镜检操作规范培训G+和G-生物学特性的差异比较项目比较项目 G+细菌细菌 G-细菌细菌 革兰氏染色反应革兰氏染色反应 能阻留结晶紫而染成紫色能阻留结晶紫而染成紫色 可经脱色而复染成红色可经脱色而复染成红色 肽聚糖肽聚糖 厚，层次多厚，层次多 薄，一般单层薄，一般单层 磷壁酸磷壁酸 多数含有多数含有 无无 外膜外膜 无无 有有 脂多糖（脂多糖（LPS） 无无 有有 类脂和脂蛋白含量类脂和脂蛋白含量 低（仅抗酸性细菌含有类低（仅抗酸性细菌含有类脂）脂） 高高 鞭毛结构鞭毛结构 基体上着生基体上着生2个环个环 基体上着生基体上着生4个环个环 产毒素产毒素 以外毒素为主以外毒素为主 以内毒素为主以内毒素为主 对机械力的抗性对机械力的抗性 强强 弱弱 6革兰氏染色及镜检操作规范培训阴性菌阴性菌阳性菌阳性菌7革兰氏染色及镜检操作规范培训二、革兰氏染色原理二、革兰氏染色原理G+菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多且交联程度菌由于其细胞壁较厚，肽聚糖网层次多且交联程度大，故经酒精脱色，失水而使网孔缩小，再加上它不大，故经酒精脱色，失水而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故酒精处理，能把结晶紫和碘的复合物牢牢含类脂，故酒精处理，能把结晶紫和碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。留在壁内，使其保持紫色。8革兰氏染色及镜检操作规范培训G-菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄菌因其细胞壁薄，外膜层类脂含量高，肽聚糖层薄且交联程度低（松疏），经酒精脱色后，以类脂为主且交联程度低（松疏），经酒精脱色后，以类脂为主的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色，再结晶紫与碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色，再经沙黄等红色染料复染，就使经沙黄等红色染料复染，就使G-菌呈红色。菌呈红色。9革兰氏染色及镜检操作规范培训三、仪器设备、试剂三、仪器设备、试剂生物显微镜生物显微镜载玻片载玻片草酸铵结晶紫染色液草酸铵结晶紫染色液革兰氏碘液革兰氏碘液沙黄复染液或番红染色液沙黄复染液或番红染色液95%乙醇乙醇10革兰氏染色及镜检操作规范培训5、革兰氏染色液配制、革兰氏染色液配制5.1草酸铵结晶紫染液草酸铵结晶紫染液A液：结晶紫液：结晶紫2g，95%乙醇乙醇20mL。B液：草酸铵液：草酸铵0.8g，蒸馏水蒸馏水80mL混合混合A液及液及B液，静置液，静置48h后使用。后使用。11革兰氏染色及镜检操作规范培训5.2碘液配制碘液配制碘片碘片1g，碘化钾碘化钾2g，蒸馏水，蒸馏水300mL配制方法：先将碘化钾溶解在少量水中，配制方法：先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加够蒸馏水即可。后，加够蒸馏水即可。12革兰氏染色及镜检操作规范培训5.3番红复染液配制番红复染液配制番红番红2.5g，95%乙醇乙醇100mL取上述配好的番红乙醇溶液取上述配好的番红乙醇溶液10mL与与80mL蒸馏水混匀既成。蒸馏水混匀既成。13革兰氏染色及镜检操作规范培训四、操作方法四、操作方法1、制片、制片在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水。在干净的载玻片上滴上一滴蒸馏水。用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载用接种环进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层。厘米的薄层。14革兰氏染色及镜检操作规范培训为避免因菌数过多聚成团，不利观察个体形态，为避免因菌数过多聚成团，不利观察个体形态，可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。若材料为液体培养物或固体培养物冲洗下制备的若材料为液体培养物或固体培养物冲洗下制备的菌液，则直接涂布于载玻片上即可菌液，则直接涂布于载玻片上即可15革兰氏染色及镜检操作规范培训2、自然干燥、自然干燥涂片最好在室温下使其自然干燥。涂片最好在室温下使其自然干燥。有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。以防标本烤枯而变形。16革兰氏染色及镜检操作规范培训3、固定、固定标本干燥后即进行固定，固定的目的：标本干燥后即进行固定，固定的目的：）杀死微生物，固定细胞结构。）杀死微生物，固定细胞结构。）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。被水冲洗掉。）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。活的原生质易于染色。17革兰氏染色及镜检操作规范培训手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上。手执载玻片的一端（涂有标本的远端），标本向上。在酒精灯外焰尽快的来回通过在酒精灯外焰尽快的来回通过34次，共约次，共约23秒秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过为宜（不超过60）,放置待冷后，进行染色。放置待冷后，进行染色。18革兰氏染色及镜检操作规范培训4、初染、初染滴草酸铵结晶紫染滴草酸铵结晶紫染1分钟分钟蒸馏水冲洗。蒸馏水冲洗。19革兰氏染色及镜检操作规范培训5、媒染、媒染加革兰氏碘液染加革兰氏碘液染1分钟分钟蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去水分。蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去水分。20革兰氏染色及镜检操作规范培训6、脱色、脱色加加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后立即用蒸馏水冲洗。秒后立即用蒸馏水冲洗。用吸水纸吸去水分。用吸水纸吸去水分。21革兰氏染色及镜检操作规范培训7、复染、复染蕃红染色液（稀）（或沙黄）复染液染蕃红染色液（稀）（或沙黄）复染液染1分分钟后，用蒸馏水冲洗，并自然干燥。钟后，用蒸馏水冲洗，并自然干燥。镜检。镜检。22革兰氏染色及镜检操作规范培训五、镜检及结果判定五、镜检及结果判定接通显微镜的电源，调节光线的强度。接通显微镜的电源，调节光线的强度。将载玻片放在载物台上，调节镜头至油镜镜头处，将载玻片放在载物台上，调节镜头至油镜镜头处，调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋至清晰为止。调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋至清晰为止。观察菌落形态及菌体的颜色。观察菌落形态及菌体的颜色。革兰氏阳性菌染色呈紫色，革兰氏阴性菌染色呈革兰氏阳性菌染色呈紫色，革兰氏阴性菌染色呈红色。红色。23革兰氏染色及镜检操作规范培训六、六、革兰氏染色图片24革兰氏染色及镜检操作规范培训革兰氏染色的大肠杆菌革兰氏染色的大肠杆菌革兰氏染色的金黄色革兰氏染色的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌葡萄球菌和大肠杆菌25革兰氏染色及镜检操作规范培训革兰染色的伤寒沙门菌革兰染色的伤寒沙门菌革兰染色的福氏志贺菌革兰染色的福氏志贺菌26革兰氏染色及镜检操作规范培训七、七、革兰氏染色注意事项标本涂片不能太厚，若涂片较厚，应延长脱标本涂片不能太厚，若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不在出现紫色为止。色时间，直至不在出现紫色为止。染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水。应吸去玻片上的残水。27革兰氏染色及镜检操作规范培训选用培养物时，选用培养物时，G+菌培养菌培养12h-16h，G-培培养养24h。菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常。菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。28革兰氏染色及镜检操作规范培训革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定，乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定，需要多加练习。需要多加练习。29革兰氏染色及镜检操作规范培训八、八、革兰氏染色小结革兰氏染色法.swf30革兰氏染色及镜检操作规范培训