流式细胞技术基础主讲 人 缪祥 2019.9.18流式细胞技术论坛流式细胞技术论坛 flowcytocoflowcytocoBD FACS Aria 1Beckman MoFlo AstriosBD Calibur我们拥有的流式细胞仪Beckman Gallios一、光源二、流动室三、软件分析系统流式细胞仪的组成 1. 1. 激光 目前最高的配置是7激光， 355nm 、405nm、 457nm 、488nm 514nm、 561nm 、633nm (Dream)355nm Side Population （SP）必须滴405nm 免疫多色分析 PACIFIC BLUE Brilliant violet(405)457nm染色体分染色体分选488nm GFP Alex488 PE PE-CY5 PE-CY7 TEX-RED Percp5-5 .514nm YFP 561nm Mcherry PE 最佳的激发波长633nm APC APC-CY7 Alexa 647 2. 2. 汞灯 现在用的比较少了，比较大的缺点是能量比较低光源 流式细胞仪的光信号 散射光信号 荧光信号荧光信号 -前向角散射光（FSC,Forward Scatter）入射激光的同向散射光信号，反映了细胞相对大小及其表面积 - 侧向角散射光 （SSC, Side Scatter）入射激光90角的散射光信号，反映了细胞粒度及细胞内相对复杂性荧光素吸收激光能量后将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子 前向角散射光 FSCForward angle light scatterFALSFALSSensorLaser 侧向角散射光SSCFALSSensor90LSSensorLaserFSC-SSC ApplicationWhat can we read from this fsc-ssc dot plot?1.FSC 从左往右 细胞越来越大，反应细胞直径3.FSCSSC 图能够帮助大家判断细胞的相对大小，细胞越大FSC的电压值越小2.SSC从下往上细胞内部颗粒越来越多，反应被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状荧光是怎么产生的呢？510nm-530nm阴性细胞为何有峰图?FITCAlexa488Alexa488Synthetic,organicdyes:AlexaFluors,Cydyes,Horizon,Dylight,etcProteins:PE,APC,GFP,mCherrySemiconductornanocrystals:Qdots,Crystalplex,eFluorNCOrganicpolymers:BrilliantVioletTMHigh-SensitivityFluorescenceAlexa488 fluorescent chemistry familiescoumarintryptophan350Pacific BlueAlexa 488FITCAlexa 568/ rhodamineTexas RedCy7Organic fluorophores复合染料-PE-Cy5If the flourophores have overlapping spectral properties with proximal and proper orientationThe Donor molecule (PE) transfers it energy to excite the Acceptor molecule (Cy5) instead of emitting photonsThe excited Acceptor then releases the energy at its emission wavelengthPECy5PECy5Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)0 hours2 hours22.5 hoursPE(FL2)PE-Cy5PE-Cy7Time Sample Left in LightTandem Conjugates functionality can be sensitive to the environment如何选择荧光染料 1、根据现有的仪器所有的激光器与通道进行选择，不能只有488nm、633nm 的激光却选择405nm激光激发的荧光素 ，calibur 是双激光4色的流式细胞仪，所包含通道FITCPEPERCP5-5APC2、表达比较弱的选择比较强的荧光素，表达比较强的选择较弱的荧光素 CD133一般都选择PE MHC-II 一般选择FITC等较弱的荧光素，在很多情况下它的表达太高 PE是常用荧光素中亮度最强的 FITC比较弱，比较稳定3、在可以的情况下选择荧光补偿最小的荧光素，比如FITC PERCP5-5、APC4、优先选择直标抗体，没法子的时候才选择间标 能不选择复合染料尽量不要选择复合染料 比如PE-CY 5 PE-CY7 CV比较大 补偿较大5、PE-CY5尽量不与APC一起染，因为他们的发射波长几乎重叠FluorophoreBrightnessindexabundanceofAgproblematicbackgroundfavoriteratingBV4215thelowesthighestBV5703-4midBleedsintoPEandBV421middlePacificBlue1lowmidtohighhighPacificOrange1veryhighverylowV5001VeryhighlowFITC/AF4883lowtomidbleedsintoPEhighPerCP-Cy5.53midcrossbeamintoAF700middlePE5lowtomidmiddlePE-TR2-3midbleedsintoPEandPE-Cy5verylowPE-Cy54lowtomidcrossbeamintoAPCandbleedsintoPElowPE-Cy74lowbleedsmostofalltandemsintoPEandcrossbeamintoAPC-Cy7middle-lowAPC/AF6475lowtomidhighAF7002midtohighmiddleAPC-Cy72midbleedsintoAPClow荧光染料亮度与受欢迎程度流动室流动室(分选分选) 软件分析系统软件分析系统分析软件1. 机器自带分析软件：SUMMIT2.第三方分析软件：Kaluza， Flowjo， Facs express, CFCS3.特殊分析软件 ：周期分析软件Modifit , WincyleflowcytocoWhat does compensation mean?Compensationistheprocessbywhichthefluorescence“spillover”originatingfromafluorochromeotherthantheonespecifiedforaparticularPMTdetectorissubtractedasapercentageofthesignalfromotherPMTs.overlapbetweenFITCandPEproducesphotonsdetectedbybothFITC(FL1)andPE(FL2)detectors.TheamountofphotonsfromFITCfluorescenceleakingintothePEdetectormustthereforebecompensatedout.Analog Compensationex. FITCArgon LaserFL3FL1FL2%450500550600FITCCyCPETrue FL2= FL2 x% of FL1FL2PEFL1FITCTotal signal detected in FL1Unwanted signal detected in FL2roughly 15%FL2 15% FL1Unwanted signal detected in FL2roughly 15%Total signal detected in FL1Uncompensated FITCFL2-15%FL1UncompensatedCompensatedFL2-30%FL1Over CompensatedTime (msec)Signal Intensity (channel)IntensityNo. of Cells/Channel如何看流式图散点图这张图你能看出什么？如何看流式图直方图双峰单峰细胞周期Model: %G0-G1: 77.75 at 69.82 %S: 11.87 %G2-M: 10.37 at 139.65 %CV: 6.52RCS: 1.246Linear or Log AmplificationLinear amplifierLog amplifierCD8 Expression of LymphocytesWhen do we use linear amplifier?Cell cycle associated assayEx: PI ; Hochest ; 7AAD Brdu-PI ; Brdu-7AADWhen do we use log amplifier?Mean 平均值 即所有细胞的荧光强度相加，再除以细胞数GeoMean 几何平均数 即所有细胞的荧光强度相乘，再进行N次开方，N= 细胞数Median 中位数 是对所有细胞的荧光强度进行排序，位于50处的荧光强度值平均荧光强度如何准备对照以三色CD4-FITC、CD8-PE、CD19-PeCy7为例，对照组如下： blank：调电压； FITC单标：调补偿； PE单标：调补偿； PeCy7单标：调补偿； FITC FMO对照： 加FITC-IgG、 CD8-Pe和CD19-PeCy7； PE FMO对照： 加FITC-CD4、PE-IgG和CD19-PeCy7； PeCy7 FMO对照：加FITC-CD4、PE-CD8和IgG-PeCy7；FMO ControlIso controlBlank Fluorescence Minus One (FMOFMO) Control空染Isotype 相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白 ：CD4 fitc IgG1-fitc IgG12.当不能确定阴性或者阳性的位置的时候需要找阴性、弱阳 性对照例如：做凋亡的时候，空白对照与PI单染几乎没有意义，这个时候可以找这群细胞不凋亡或者凋亡很少的来做对照即可除了以上3种对照我们还需要做什么对照呢？1.以Treg为例： CD4CD25FOXP33.临床做强制性脊柱炎的时候是需要小球来做阳性对照阴性阴性阳性阳性如何去除粘黏细胞破膜后的FSC-SSC有什么变化破膜前破膜后为什么PBMC的单核细胞也有CD4的表达CD4CD4CD4凋亡的细胞PIANNEXIN V现在明白这张图能给我们什么信息么？活化增殖FSC-SSC谢谢流式细胞技术论坛流式细胞技术论坛 flowcytocoflowcytoco