实验四、植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应一、实验目的一、实验目的（一）掌握分光光度法测定过氧化氢酶的方法；（二）重金属对过氧化氢酶的影响及其机理。实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应酶：由活细胞产生的具催化功能的蛋白质；酶催化底物发生的生物化学反应（酶促反应）；实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应与一般催化剂的相同点与一般催化剂的相同点反应中质与量不变，用量少、缩短平衡时间，不改反应中质与量不变，用量少、缩短平衡时间，不改变平衡点、只催化特定反应、降低反应活化能。变平衡点、只催化特定反应、降低反应活化能。不同点不同点高效高效 （10106 6-10-101313）高度专一高度专一 对反应和反应物有严格选择性对反应和反应物有严格选择性条件温和（酶易失活）条件温和（酶易失活） 引起蛋白质变性的因素都能引起蛋白质变性的因素都能使酶失活使酶失活实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应 2H2O2 2H2O+ O2 过氧化氢酶过氧化氢酶(catalase)n n干旱、重金属等环境胁迫下植物机体内容易产生干旱、重金属等环境胁迫下植物机体内容易产生ROSROS（ReactiveOxygenSpeciesReactiveOxygenSpecies）如：）如：O O2-2-、H H2 2O O2 2、OHOH- -等，因此激发保护酶体系（过氧化物酶等，因此激发保护酶体系（过氧化物酶PODPOD、超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶SODSOD、过氧化氢酶（、过氧化氢酶（CATCAT）清除）清除自由基，提高抗逆性。自由基，提高抗逆性。实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应几几乎乎所所有有的的生生物物机机体体都都存存在在过过氧氧化化氢氢酶酶，其其普普遍遍存存在在于于能能呼呼吸吸的的生生物物体体内内，主主要要存存在在于于植植物物的的叶叶绿绿体体、线线粒粒体体、内内质质网网、动动物物的的肝肝和和红红细细胞胞及及某某些些组组织织内内的的过过氧氧化化体体中中，其其酶酶促促活活性性为为机机体体提提供供了了抗抗氧氧化化防防御御机机理理。主主要要作作用用就就是是催催化化H H2 2O O2 2分分解解为为H H2 2O O与与O O2 2，使使得得H H2 2O O2 2不不致致于于与与O O2 2在在铁铁螯螯合合物物作作用用下下反反应应生生成成非非常有害的常有害的OHOH- - 。实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应二、实验原理二、实验原理n nCu2+使植物体内活性氧代谢加强，H2O2积累，使细胞受害，而过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶防御系统之一。植物体内H2O2含量，过氧化氢酶活性与植物抗逆性密切相关。n nH2O2在240nm具有强烈吸收峰。实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应三、实验仪器和用具三、实验仪器和用具（一）实验器材（一）实验器材光照培养箱、白瓷盘、医用纱布、烧杯、移液器、光照培养箱、白瓷盘、医用纱布、烧杯、移液器、离心机、离心管、电炉、紫外分光光度计、天平、离心机、离心管、电炉、紫外分光光度计、天平、研钵、容量瓶（研钵、容量瓶（25ml25ml）、试管、水浴锅。）、试管、水浴锅。（二）材料（二）材料水稻种子。水稻种子。（三）试剂（三）试剂2.0mMCuSO2.0mMCuSO4 4、磷酸缓冲液、木村、磷酸缓冲液、木村B B培养液。培养液。实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应四、实验方法和内容四、实验方法和内容前处理n n浸种催芽n n培养（木村B培养液，20培养至2叶1心）n n处理（对照和2.0mMCuSO4处理）实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应1.酶液的提取称取新鲜水稻叶片0.5g置于研钵中，加入2-3ml4预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中。用缓冲液冲洗研钵数次，并合并冲洗液，定容。容量瓶于4冰箱中静置10min，取上清液在4000rpm下离心10min，上清即为粗酶液。实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应冰箱中静置10min4000rpm下离心10min实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应2.测定取10ml试管3支，其中2支为样品管，1支为空白管，按表1加入试剂。实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应表1紫外分光光度法测定H2O2样品配置表mlmlS0S0S1S1S2S2粗酶液粗酶液0.20.20.20.20.20.2磷酸缓冲液磷酸缓冲液1.51.51.51.51.51.5蒸馏水蒸馏水1.01.01.01.01.01.0H H2 2O O2 20.30.30.30.30.30.3对照管：煮沸3-5min;样品管25预热5min实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应样品管25预热后，逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4次。对照管在煮沸5min后加入H2O2，并测定。等3支试管测定完后按下式计算酶活性。实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应T T（minmin）A As0s0A As1s1A As2s2o o1 12 23 3数据记录实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应3.结果计算式中实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应AS0加入煮沸酶液的对照管吸光值；AS1，AS2样品管吸光值；VT粗酶提取液总体积（25ml）；V1测定用粗酶液体积（0.2ml）；FW样品鲜重；0.1A240每下降0.1为1个酶活力单位；t从加过氧化氢到最后一次读数的时间（3min）。实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应四、注意事项凡在240nm具强烈吸收的物质对本实验有干扰。五、思考题分析所得结果，说明此浓度重金属对过氧化氢酶有无明显影响。实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应实验四植物体内过氧化氢酶对环境中重金属污染的响应