细胞化学染色检验细胞化学染色检验 一、过氧化物酶染色（一、过氧化物酶染色（POX)POX)目的目的: 了解过氧化物酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。了解过氧化物酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。原理原理(四甲基联苯胺法）四甲基联苯胺法）: 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶酶(peroxidase, POX)，POX能将底物四甲基联苯胺能将底物四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)氢离子传递给氢离子传递给H2O2，使之氧化为四甲基联苯胺蓝。，使之氧化为四甲基联苯胺蓝。四甲基联苯胺蓝又可与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗四甲基联苯胺蓝又可与亚硝基铁氰化钠结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞质酶所在部位。若无亚硝基铁氰化钠，四甲基联苯胺蓝则自我粒，定位于细胞质酶所在部位。若无亚硝基铁氰化钠，四甲基联苯胺蓝则自我脱氢氧化成棕色的四甲基苯醌二胺沉着于酶所在部位。脱氢氧化成棕色的四甲基苯醌二胺沉着于酶所在部位。1 1.取取0.1TMB乙醇溶液乙醇溶液1ml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10l，溶液呈淡，溶液呈淡 棕黄色。染色液应在临用前配制。棕黄色。染色液应在临用前配制。2.在新鲜干燥的涂片上，加在新鲜干燥的涂片上，加0.1TMB-亚硝基铁氰化钠饱和溶液的混合试亚硝基铁氰化钠饱和溶液的混合试剂剂0.5ml，放置，放置1min后，再加稀过氧化氢溶液后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml，吹匀，染色，吹匀，染色6min。3.直接用流水冲洗，待干，再用瑞氏染液复染直接用流水冲洗，待干，再用瑞氏染液复染1520min。4.流水冲洗后，待干，用油镜镜检。流水冲洗后，待干，用油镜镜检。5.结果判断结果判断 在细胞质中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性反应。在细胞质中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性反应。 阴阴 性：无颗粒。性：无颗粒。 弱阳性：颗粒小，分布稀疏。弱阳性：颗粒小，分布稀疏。 阳阳 性：颗粒略粗，分布较密集。性：颗粒略粗，分布较密集。 强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。 方法步骤方法步骤2 注意事项注意事项 1.1.涂片应新鲜制作、厚薄适宜。涂片应新鲜制作、厚薄适宜。2.2.TMB TMB 配制在配制在85858888的乙醇溶液中染色效果较好，勿用的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90909595乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而使显色反应减弱或消失。渗入而使显色反应减弱或消失。3.3.过氧化氢溶液需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂过氧化氢溶液需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示过片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示过氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效。氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效。4.4.染色液适宜染色液适宜pHpH值应为值应为5.55.5，若，若pHpH值值 5.05.0会出现假阳性结果。会出现假阳性结果。5.5.试剂应置于低温暗处，防止光线照射失效。试剂应置于低温暗处，防止光线照射失效。6.6.染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀，否则同染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀，否则同一片子上细胞染色情况不一致。一片子上细胞染色情况不一致。3 临床意义临床意义 POX染色是鉴别急性粒细胞白血病染色是鉴别急性粒细胞白血病(acute myeloblastic leukemia, AML)、急性单核细胞白血病、急性单核细胞白血病(acute monocytic leukemia, AMOL)、 急性急性淋巴细胞白血病淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL)的重要细胞化学染的重要细胞化学染色方法。色方法。AML时白血病细胞可呈阳性反应时白血病细胞可呈阳性反应, 阳性颗粒一般较多，阳性颗粒一般较多， 较粗大，较粗大，常呈局限性分布；常呈局限性分布；ALL时白血病细胞呈阴性反应；时白血病细胞呈阴性反应；AMOL时白血病细胞呈时白血病细胞呈阴性或弱阳性反应，阳性时颗粒稀少、细小，呈弥散分布。阴性或弱阳性反应，阳性时颗粒稀少、细小，呈弥散分布。4过碘酸过碘酸- -雪夫反应雪夫反应(PAS)(PAS) 目的目的: 了解过碘酸了解过碘酸-雪夫反应的原理、方法、注意事项和临床意义。雪夫反应的原理、方法、注意事项和临床意义。原理原理: 过碘酸过碘酸-雪夫反应雪夫反应(Periodic acid Schiff reaction, PAS)又称糖又称糖原染色，其原理为过碘酸可将细胞内含有原染色，其原理为过碘酸可将细胞内含有1,2-乙二醇基的糖类氧化而乙二醇基的糖类氧化而产生双醛基，后者与雪夫产生双醛基，后者与雪夫(Schiff)染料作用，使无色品红变为紫红色染料作用，使无色品红变为紫红色的化合物，定位于含有多糖类的胞质中。根据胞质中糖原种类及含的化合物，定位于含有多糖类的胞质中。根据胞质中糖原种类及含量多少，可呈现粗细不等红色颗粒、块状物或均匀红色。量多少，可呈现粗细不等红色颗粒、块状物或均匀红色。5 方法步骤方法步骤 1.新鲜干燥的涂片用新鲜干燥的涂片用95乙醇固定乙醇固定10min，流水冲洗，待干。，流水冲洗，待干。2.加入加入10g/L过碘酸氧化过碘酸氧化1520min，蒸馏水冲洗，待干。，蒸馏水冲洗，待干。3.置雪夫染液中置雪夫染液中37(或室温或室温)染色染色3060min。4.用亚硫酸溶液冲洗用亚硫酸溶液冲洗3次后，再用流水冲洗次后，再用流水冲洗23min，待干。，待干。5.20g/L甲绿复染甲绿复染1020min。6. 水洗，待干，镜检。水洗，待干，镜检。7. 结果判断：如在胞质中出现弥散状、颗粒状或块状红色为阳性。胞质无结果判断：如在胞质中出现弥散状、颗粒状或块状红色为阳性。胞质无色或无颗粒为糖原阴性。反应强度判断标准如下：色或无颗粒为糖原阴性。反应强度判断标准如下： 6 （1 1）中性粒细胞的分级标准：）中性粒细胞的分级标准： 0 0分胞质无色。分胞质无色。 1 1分胞质内呈淡红色，有极少颗粒。分胞质内呈淡红色，有极少颗粒。 2 2分胞质呈红色，厚而不透明，或有少量颗粒。分胞质呈红色，厚而不透明，或有少量颗粒。 3 3分胞质呈深红色，颗粒较紧密，但尚有空隙。分胞质呈深红色，颗粒较紧密，但尚有空隙。 4 4分胞质呈深紫红色，颗粒紧密，无空隙。分胞质呈深紫红色，颗粒紧密，无空隙。（2 2）淋巴细胞分级标准：）淋巴细胞分级标准： 0 0分胞质内无色。分胞质内无色。 1 1分胞质内呈弥散淡红或有少数细颗粒分胞质内呈弥散淡红或有少数细颗粒(10(10个个) )。 2 2分胞质内呈弥散较深的红色或有多数细颗粒分胞质内呈弥散较深的红色或有多数细颗粒(10(10个个) )。 3 3分胞质内有较粗颗粒或少数小块状红色物质。分胞质内有较粗颗粒或少数小块状红色物质。 4 4分胞质内呈多数粗颗粒并有大块红色物质。分胞质内呈多数粗颗粒并有大块红色物质。7 （3 3）幼红细胞的分级标准：）幼红细胞的分级标准： 0 0分胞质内无色。分胞质内无色。 1 1分胞质内有少数分散细小颗粒或浅红色弥漫物质。分胞质内有少数分散细小颗粒或浅红色弥漫物质。 2 2分胞质中有分胞质中有1 12 2个浓的颗粒或胞质呈弥散红色。个浓的颗粒或胞质呈弥散红色。 3 3分胞质中有较粗红色颗粒直至小块红色物质。分胞质中有较粗红色颗粒直至小块红色物质。 4 4分胞质中有粗大红色块或有粗大致密的紫红色颗粒。分胞质中有粗大红色块或有粗大致密的紫红色颗粒。（4 4）巨核细胞的分级标准：）巨核细胞的分级标准： 0 0分胞质内无红色颗粒，但仍呈弥散性着色，此系其它多糖类物质。分胞质内无红色颗粒，但仍呈弥散性着色，此系其它多糖类物质。 1 1分少量糖原包涵体，常定位于核膜附近。分少量糖原包涵体，常定位于核膜附近。 2 2分中等量糖原包涵体，定位于核膜处或分散在胞质中，约占胞质的分中等量糖原包涵体，定位于核膜处或分散在胞质中，约占胞质的1/31/3。 3 3分大量糖原包涵体分散于胞质中，占胞质分大量糖原包涵体分散于胞质中，占胞质1/21/2。 4 4分糖原包涵体充满整个胞质。分糖原包涵体充满整个胞质。8 1.1.所用染色缸及器具应十分清洁、干燥。所用染色缸及器具应十分清洁、干燥。2.2.雪夫雪夫(Schiff)(Schiff)染液应避光密封冰箱保存，一般染液应避光密封冰箱保存，一般44下可保存下可保存6 6个月，个月，试剂应为无色，变红则失效。试剂应为无色，变红则失效。3.3.10g/L10g/L过碘酸溶液质量要保证，变黄则不能用。氧化时间要准确，以过碘酸溶液质量要保证，变黄则不能用。氧化时间要准确，以20min20min为宜。为宜。4.4.染色时间和温度应相对恒定，一般以染色时间和温度应相对恒定，一般以3737染色染色30min30min最适宜。最适宜。5.5.染色好的涂片应及时检查，以免褪色。染色好的涂片应及时检查，以免褪色。6.6.偏重亚硫酸钠易于分解，过碘酸易潮解，应密封干燥保存。偏重亚硫酸钠易于分解，过碘酸易潮解，应密封干燥保存。7.7.碱性品红的质量对实验结果有影响。碱性品红的质量对实验结果有影响。注意事项注意事项9 1.红血病、红白血病及贫血类型的鉴别：红血病、红白血病、缺铁红血病、红白血病及贫血类型的鉴别：红血病、红白血病、缺铁性贫血、重型地中海贫血及骨髓增生异常综合征时幼红细胞呈强性贫血、重型地中海贫血及骨髓增生异常综合征时幼红细胞呈强阳性反应；溶血性贫血、急慢性白血病、淋巴瘤时幼红细胞呈阴阳性反应；溶血性贫血、急慢性白血病、淋巴瘤时幼红细胞呈阴性反应或弱阳性反应；再生障碍性贫血、巨幼细胞贫血时幼红细性反应或弱阳性反应；再生障碍性贫血、巨幼细胞贫血时幼红细胞呈阴性反应。胞呈阴性反应。2.白血病类型的鉴别：白血病类型的鉴别：AML原始粒细胞与早幼粒细胞呈阴性或弱阳原始粒细胞与早幼粒细胞呈阴性或弱阳性反应，以弥漫性反应为主；性反应，以弥漫性反应为主；ALL原、幼淋巴细胞多呈块状阳性原、幼淋巴细胞多呈块状阳性反应，也有少数呈阴性反应；反应，也有少数呈阴性反应；AMOL原、幼单核细胞呈强阳性反原、幼单核细胞呈强阳性反应，其颗粒细小，弥散分布。应，其颗粒细小，弥散分布。临床意义临床意义10