生物学实验室仪器的应用与实验技术生物学实验室仪器的应用与实验技术Theapplicationsandtechniquesofexperimentalequipmentsinbiology张学琴张学琴生命科学大楼生命科学大楼4027室室Tel:62732654,62734837Email:zhangxq711-1163.com讲课老老师内容内容时间讲课地点地点实验地点地点张学琴离心机9月12，14日生命科学大楼B080生命科学大楼4015 张学琴张学琴光谱9月19，21日生命科学大楼B080生命科学大楼4051 张学琴凌毅芯片9月26，28日生命科学大楼B080生命科学大楼2060 闫红刘毅敏Confocal10月10，12日生命科学大楼B080生命科学大楼4012 刘毅敏张远涛(张学琴)定量PCR仪10月17，19日生命科学大楼B080生命科学大楼4051 张远涛陈艳梅蛋白质组学(含双向电泳和数据分析)10月24，26日生命科学大楼B080生命科学大楼2069 陈艳梅李 溱液质联仪10月31日，11月2日生命科学大楼B080生命科学大楼2069李溱张学琴考试11月16生命科学大楼B080本课程主要介绍生物学实验所用的常用仪器及本课程主要介绍生物学实验所用的常用仪器及其在生物研究中的应用。其在生物研究中的应用。主要包括：离心技术（超速和高速）；主要包括：离心技术（超速和高速）；光谱技术（紫外、原子、荧光）；光谱技术（紫外、原子、荧光）；基因芯片技术基因芯片技术显微技术（显微技术（Confocal，etc)；定量定量PCR技术技术蛋白质组学蛋白质组学液质联仪液质联仪参考书：参考书：1、周先碗胡晓倩编生物化学仪器分析与实验技术、周先碗胡晓倩编生物化学仪器分析与实验技术化学工业出版社（第三版）化学工业出版社（第三版）2、王立汪正范牟世芬丁晓静编著、王立汪正范牟世芬丁晓静编著色谱分析样品处理化学工业出版社色谱分析样品处理化学工业出版社3、师治贤王俊德编著、师治贤王俊德编著生物大分子的液相色谱分离和制备科学出版社生物大分子的液相色谱分离和制备科学出版社（第二版）（第二版）4、www.baidu.com5、www.google.com结课方式：结课方式：考试（考试（50%）课程论文（课程论文（50%）一、离心技术一、离心技术二、离心机的种类二、离心机的种类三、离心机和转头的维护三、离心机和转头的维护四、离心机的事故四、离心机的事故五、离心技术在样品制备中的作用五、离心技术在样品制备中的作用第一章离心技术第一章离心技术1.离心机发展历史离心机发展历史2.基本概念基本概念3.离心分离方法离心分离方法一、离心技术一、离心技术19世纪手摇离心机蜂蜜、牛奶世纪手摇离心机蜂蜜、牛奶20世纪超速离心机生物学、医世纪超速离心机生物学、医学、制药工业等广泛应用。学、制药工业等广泛应用。1.离心机发展历史离心机发展历史1923年年瑞典化学家瑞典化学家Svedberg第一台具有第一台具有光学系统的分析超速离心机，最高转速达光学系统的分析超速离心机，最高转速达45,000rpm。1926年年Svedberg测定马血红蛋白分子量，测定马血红蛋白分子量，首次证明蛋白质为均一的生物大分子。首次证明蛋白质为均一的生物大分子。1940年年Svedberg和同事和同事Pederson撰写世界撰写世界上第一本有关离心技术的专著。上第一本有关离心技术的专著。超速离心技术发展阶段超速离心技术发展阶段1951年年BrakkeMK在差速离心的基础在差速离心的基础上发展了速率区带离心法。上发展了速率区带离心法。1955年年AndersonNG发明了区带转头，发明了区带转头，并用区带离心法首次证明并用区带离心法首次证明DNA双螺旋结构双螺旋结构半保留复制的假说。半保留复制的假说。离心机制造工艺；区带转头；高强度离心机制造工艺；区带转头；高强度的钛合金的应用；半导体集成电路；计算的钛合金的应用；半导体集成电路；计算机技术的发展；高频调速电机的使用。机技术的发展；高频调速电机的使用。20世纪世纪90年代中期年代中期碳素转头（超强超轻材料合成），碳素转头（超强超轻材料合成），抗拉强度比钛合金强。抗拉强度比钛合金强。1、基本概念、基本概念(1)、离心技术离心技术（CentrifugeTechnique）:利用物质在离心力作用下，按其沉降系利用物质在离心力作用下，按其沉降系数不同而分离的一种技术。数不同而分离的一种技术。(2)、沉降现象沉降现象任何物体受地球引力的作用都具有下沉任何物体受地球引力的作用都具有下沉的现象，称为的现象，称为沉降现象沉降现象。=gt(g为重力加速度，为重力加速度，980cm/s2)。物体在沉降过程中，其下沉的力在某个时刻物体在沉降过程中，其下沉的力在某个时刻总会与摩擦力、浮力达到平衡，使物体的受力总会与摩擦力、浮力达到平衡，使物体的受力为零，此时物体在做为零，此时物体在做匀速运动匀速运动，此时的速度称为，此时的速度称为临界速度临界速度。一个球型颗粒在具有重力场中的液体介质内，一个球型颗粒在具有重力场中的液体介质内，受到受到地球引力地球引力、溶液浮力溶液浮力和和溶液黏滞力溶液黏滞力的作用，的作用，出现不同的运动（粘滞力和浮力向上，重力向下）出现不同的运动（粘滞力和浮力向上，重力向下）。重力重力Fg1/6d3pg(d为颗粒直径，为颗粒直径，为颗粒密度，为颗粒密度，g为重力加速度为重力加速度)。（3）颗粒在重力场的运动）颗粒在重力场的运动粘滞力粘滞力Ff=-3dV(V为颗粒沉降速度为颗粒沉降速度)浮力浮力Fb=-1/6d3mg(m为介质密度为介质密度)当作用在颗粒上的总力为零时，颗粒做匀速运当作用在颗粒上的总力为零时，颗粒做匀速运动，即达到临界速度，作用力的关系式为：动，即达到临界速度，作用力的关系式为：Fg=Fb+Ff；Vd2(p-m)g/18（a）、与颗粒直径）、与颗粒直径d2的大小成正比，颗粒大的大小成正比，颗粒大沉降快。沉降快。（b）、与颗粒和介质密度差）、与颗粒和介质密度差(p-m)成正比，成正比，密度之差越大，沉降越快。密度之差越大，沉降越快。（c）、当）、当pm，颗粒沉降速度为正值，即，颗粒沉降速度为正值，即颗粒在介质中往下沉；等于，做不定向运动；颗粒在介质中往下沉；等于，做不定向运动；小于，颗粒在介质中上浮。小于，颗粒在介质中上浮。Vd2(p-m)g/18（d）、与引力）、与引力g成正比，速度随着引力成正比，速度随着引力的增加而增加。的增加而增加。（e）、与介质粘度）、与介质粘度成反比，速度随粘成反比，速度随粘度的增加而降低度的增加而降低（4）颗粒在离心场中的沉降）颗粒在离心场中的沉降5种力：种力：离心力，向心力离心力，向心力，重力，浮力，重力，浮力，介质摩擦力介质摩擦力从理论上讲，只要颗粒的比重大于液从理论上讲，只要颗粒的比重大于液体就会发生沉降，但是对于分离生物材料体就会发生沉降，但是对于分离生物材料的样品，如细胞、细胞器、细菌、病毒、的样品，如细胞、细胞器、细菌、病毒、蛋白质和核酸等生物大分子来说，由于颗蛋白质和核酸等生物大分子来说，由于颗粒非常细小，依靠自然沉降是不能达到完粒非常细小，依靠自然沉降是不能达到完全分离的，只能通过全分离的，只能通过离心力的作用离心力的作用才能使才能使它们沉降下来。它们沉降下来。离心力的产生离心力的产生离心场的受力：离心场的受力：G2r物体在围绕转轴以角速度旋转时，就产生物体在围绕转轴以角速度旋转时，就产生离心场，物体在离心场中受到离心力的作用。离心场，物体在离心场中受到离心力的作用。电机的速度以每分钟的转数（电机的速度以每分钟的转数（r/min）表示。）表示。G2r42N2r/3600(N为每分钟的转数，单位为为每分钟的转数，单位为r/min；G的单位是的单位是cm/s2，正好与重力加速度，正好与重力加速度g的单位的单位一致。一致。)在实践中，离心力可用重力加速度的在实践中，离心力可用重力加速度的倍数倍数G/g来表示，称之为来表示，称之为相对离心力相对离心力，用，用RCF表示，表示，可将公式写成：可将公式写成：RCFG/g=(42N2r/3600)/980=1.1210-5N2rN=1000(RCF/11.2r)1/2相对离心力（相对离心力（RCF）因此，因此，超速离心常用重力加速度的倍数超速离心常用重力加速度的倍数（g）来代替转速（）来代替转速（r/min），真正反映颗），真正反映颗粒在离心管中所受到的离心力。粒在离心管中所受到的离心力。一般，低速离心，转速以一般，低速离心，转速以r/min表示；表示；高速离心，转速以重力加速度高速离心，转速以重力加速度g表示。表示。计算颗粒相对离心力时，应注意离心管计算颗粒相对离心力时，应注意离心管与中心轴间的距离，即离心半径与中心轴间的距离，即离心半径r的长度。离的长度。离心管所处的位置不同，沉降颗粒所承受的离心管所处的位置不同，沉降颗粒所承受的离心力也不同。心力也不同。沉降系数（沉降系数（sedimentationcoefficient,S）S= /2r=(p-m)d2 8沉降系数是生物大分子的特征常数，与颗粒密度、沉降系数是生物大分子的特征常数，与颗粒密度、形状、大小，与介质密度、粘度，与温度、浓度都形状、大小，与介质密度、粘度，与温度、浓度都有关系。有关系。20，以水为介质的条件下，测得S值为标准状态下的S值。1S=10-13秒K因子因子(表示沉降系数为s的颗粒，在转头的最大速度下离心时，颗粒从小半径沉降到大半径所需要的时间。)t=K/s表示从离心管表面沉降到离心管底所需要的时间。表示从离心管表面沉降到离心管底所需要的时间。K是转头的实际参数是转头的实际参数沉降与相关因素沉降与相关因素离心速度离心速度其大小决定颗粒沉降的快慢，不其大小决定颗粒沉降的快慢，不同大小的颗粒使用不同的离心速度。大颗粒，同大小的颗粒使用不同的离心速度。大颗粒，质量大，在离心场中沉降速度快，只需低速质量大，在离心场中沉降速度快，只需低速离心。反之，需高速离心。离心。反之，需高速离心。温度温度不同温度下，不同介质的粘度不同。不同温度下，不同介质的粘度不同。多数离心介质的粘度都会随着温度的变化多数离心介质的粘度都会随着温度的变化而变化。因此而变化。因此在离心时要求温度恒定在离心时要求温度恒定，尤其尤其梯度离心对温度比较敏感，对离心环境温度梯度离心对温度比较敏感，对离心环境温度要求较严。要求较严。离心时间离心时间离心半径离心半径设定半径的目的：设定半径的目的：一是有一定的离心体积；一是有一定的离心体积；二是根据转头大小半径决定颗粒下二是根据转头大小半径决定颗粒下沉的距离。尤其在梯度离心时，距离沉的距离。尤其在梯度离心时，距离短是不易将物质分开的。短是不易将物质分开的。t=(1013/3600)(lnrb-lnrm)/2srb：轴与离心管间距离轴与离心管间距离Rm：轴与管液面间距离轴与管液面间距离3.离心分离方法离心分离方法沉淀离心沉淀离心差速离心差速离心速率区带离心速率区带离心等密度离心等密度离心淘洗离心淘洗离心连续流离心连续流离心（1）、沉淀离心）、沉淀离心常用方法。指介质密度约常用方法。指介质密度约1g/ml，选用一种，选用一种离心速度，使悬浮液中的悬浮颗粒在离心的作离心速度，使悬浮液中的悬浮颗粒在离心的作用下完全沉淀下来，这种离心方式称用下完全沉淀下来，这种离心方式称沉淀离心沉淀离心。沉降速度与离心力和颗粒大小有关。沉降速度与离心力和颗粒大小有关。颗粒沉降离心中的两个因素：颗粒沉降离心中的两个因素：相对离心力（g）和时间（min）沉降某颗粒需10,000g* min10,000g 离 心1min100g100min1000g10min2000g5min凡是利用颗粒在离心凡是利用颗粒在离心场中的沉降系数差异进场中的沉降系数差异进行逐级分离的离心方法，行逐级分离的离心方法，称称差速离心差速离心。差速离心是建立在差速离心是建立在颗颗粒的大小、密度和形状粒的大小、密度和形状有明显的不同，沉降存有明显的不同，沉降存在较大的差异的基础上在较大的差异的基础上进行分离的方法。一般进行分离的方法。一般用于粗级分离，而不用用于粗级分离，而不用于精细分离。于精细分离。（2）、差速分级离心）、差速分级离心（3）、密度梯度离心）、密度梯度离心凡使用密度梯度介质离心的方法称这密度梯凡使用密度梯度介质离心的方法称这密度梯度离心或称区带离心。度离心或称区带离心。分辨率比差速离心高：分辨率比差速离心高：差速离心差速离心沉降系数相差沉降系数相差10倍以上；倍以上；密度梯度离心密度梯度离心沉降系数相差沉降系数相差10%20%s的颗粒的颗粒或颗粒或密度差小于或颗粒或密度差小于0.01g/ml的组分。的组分。注意两点：注意两点：一是制备梯度液时，应考虑样品体系中最小颗一是制备梯度液时，应考虑样品体系中最小颗粒的密度大于任何位置的介质密度。粒的密度大于任何位置的介质密度。二是控制离心时间，要在所需样品到达管底前二是控制离心时间，要在所需样品到达管底前停止离心。停止离心。两种类型：两种类型：速率区带离心：因颗粒的不同沉降速度而分层速率区带离心：因颗粒的不同沉降速度而分层。可分离与密度介质相当可分离与密度介质相当的细胞、细胞器、的细胞、细胞器、DNA和和蛋白质，分离效果只与分蛋白质，分离效果只与分离物质的的大小有关，与离物质的的大小有关，与介质的密度无关。介质的密度无关。等密度区带离心：因颗粒的不同密度而分层等密度区带离心：因颗粒的不同密度而分层。在等密度介质中的在等密度介质中的密度范围正好包括所有密度范围正好包括所有分离颗粒的密度。样品分离颗粒的密度。样品可以加在制成的梯度介可以加在制成的梯度介质的上面，也可以与密质的上面，也可以与密度介质混合在一起，离度介质混合在一起，离心后会形成自成型梯度。心后会形成自成型梯度。颗粒在等密度梯度的介质中，经过离心，颗粒在等密度梯度的介质中，经过离心，最终将停留在与其浮力密度相等的区域内，最终将停留在与其浮力密度相等的区域内，形成一个区带。形成一个区带。颗粒密度和介质密度达到平衡时，所形成颗粒密度和介质密度达到平衡时，所形成的颗粒区带就停止运动，延长离心时间对离的颗粒区带就停止运动，延长离心时间对离心效果无明显影响，即此时与离心时间无关。心效果无明显影响，即此时与离心时间无关。密度梯度离心的制备：密度梯度离心的制备：密度梯度溶液密度梯度溶液不均一，密度随着旋转半径的增加而增加e.g. 5%（1.018g/ml）20%(1.077g/ml)蔗糖为梯度液密度梯度材料氯化锂，氯化铯氯化铯，氯化铷，酒石酸钾，甘油甘油，蔗糖蔗糖和聚蔗糖等。梯度材料的选择不能与样品发生化学反应pH、渗透压不能影响所用的测量技术，e.g. 蛋白质280nm不能对转头有腐蚀梯度的形状预成型梯度：线性梯度，不连续的阶梯梯度，指数梯度自成型梯度蛋白质酶核核糖体亚基植物病毒细胞动植物组织中的亚细胞易上浮的脂蛋白梯度的制备不连续梯度通过手工制作梯度界面不能破坏连续梯度：梯度混合器加样用注射器将样液加在梯度液上面样品体积和浓度适量注意注意：离心管内的梯度液可承受的样品的最大浓度为该密度梯度液中最低密度梯度浓度的1/10。等密度加样：样液加在密度介质的上面或与密度介质混合在一起。不要污染样品不要破坏梯度的稳定性在操作过程中不能使气泡进入梯度中加样时注意：样品的回收手工回收二、离心机的种类二、离心机的种类1.按离心机的速度按离心机的速度： （1）、低速离心机最大转速（）、低速离心机最大转速（Vmax）一般在一般在6000r/min。（2）、高速离心机）、高速离心机Vmax25000r/min（3）、超速离心机）、超速离心机Vmax100000r/min(一一)、分类、分类2.按离心机的用途按离心机的用途：（1）、小型离心机小量快速离心）、小型离心机小量快速离心（2）、制备型大容量低速离心机）、制备型大容量低速离心机Vmax6000r/min，最大离心力，最大离心力6000g，最大容量达，最大容量达500ml6。（3）、高速冷冻离心机）、高速冷冻离心机Vmax1800021000r/min，最大离心力在，最大离心力在50000g。适用于细胞和。适用于细胞和亚细胞亚细胞的分离。的分离。（4）、超速离心机最大离心力可达）、超速离心机最大离心力可达800000g，可进行小量制备，适用于蛋白质、核酸和多糖等生可进行小量制备，适用于蛋白质、核酸和多糖等生物大分子的制备。物大分子的制备。（5）、分析型离心机用于生物大分子定性、定）、分析型离心机用于生物大分子定性、定量分析。量分析。（6）、连续流离心机处理类似于发酵液等特大）、连续流离心机处理类似于发酵液等特大体积、浓度较稀的样品，最大离心速度与高速离心体积、浓度较稀的样品，最大离心速度与高速离心机相似。机相似。3.按离心机的驱动系统按离心机的驱动系统：（1）、空气驱动离心机）、空气驱动离心机（2）、油涡轮驱动离心机）、油涡轮驱动离心机（3）、电刷电机驱动离心机）、电刷电机驱动离心机（4）、变频电机驱动离心机）、变频电机驱动离心机（二）、基本结构（二）、基本结构真空系统真空系统离心室离心室制冷系统制冷系统驱动系统驱动系统光学系统光学系统控制系统控制系统转头转头（1）、分类）、分类角转头角转头适用于差速离心、等密度离心，容适用于差速离心、等密度离心，容量大，转头内容纳的离心管多。量大，转头内容纳的离心管多。水平转头水平转头离心管组装在转头的吊桶内，离离心管组装在转头的吊桶内，离心机静止状态时离心管为垂直状态，离心时离心管心机静止状态时离心管为垂直状态，离心时离心管与轴垂直。适合于区带离心和等密度离心。与轴垂直。适合于区带离心和等密度离心。 垂直转头垂直转头适合于质粒适合于质粒DNA的纯化，不适合的纯化，不适合于差速离心。于差速离心。近垂直转头近垂直转头对质粒对质粒DNA和和RNA的分离纯化的分离纯化特别有效。特别有效。区带转头区带转头连续流转头连续流转头1.转头转头分离速度（时间，转头半径分离速度（时间，转头半径）垂直转头近垂直转头固定角转头水平转头纯度（2）、性能）、性能铝合金转头铝合金转头适合于适合于pH6-8的中性溶液离心的中性溶液离心用中性溶液洗涤用中性溶液洗涤强度不高，易加工，易碰伤。强度不高，易加工，易碰伤。高浓度盐长期接触会产生内结晶，影高浓度盐长期接触会产生内结晶，影响转头的强度。响转头的强度。温度不得超过温度不得超过60,更不能用高温灭菌处理更不能用高温灭菌处理价格便宜，使用寿命短。价格便宜，使用寿命短。不锈钢转头不锈钢转头耐腐蚀，对酸、碱、盐溶液均适宜。耐腐蚀，对酸、碱、盐溶液均适宜。机械强度高，加工难。机械强度高，加工难。质量大，离心速度不高。质量大，离心速度不高。使用寿命长，价格较便宜。使用寿命长，价格较便宜。钛合金转头钛合金转头耐腐蚀，对酸、碱（耐腐蚀，对酸、碱（pH3.5-11）溶液均适宜。）溶液均适宜。机械强度高，加工难。机械强度高，加工难。质量较大，离心速度高。质量较大，离心速度高。使用寿命长，价格较贵。使用寿命长，价格较贵。碳素转头碳素转头质量轻，有利于提速。质量轻，有利于提速。耐腐蚀，在偏酸性或偏碱性的溶液中均可使用。耐腐蚀，在偏酸性或偏碱性的溶液中均可使用。机械强度高，加工容易。机械强度高，加工容易。使用寿命长，价格昂贵。使用寿命长，价格昂贵。(3).转头的主要参数转头的主要参数 最大转速最大转速转头的抗拉强度是有限的，与转转头的抗拉强度是有限的，与转头的类型、构造和材料有关头的类型、构造和材料有关最大离心力最大离心力最大容量最大容量每个转头中容纳离心管数乘以离心每个转头中容纳离心管数乘以离心管的最大体积就是该转头的最大容量。管的最大体积就是该转头的最大容量。K因子因子在最大的转头速度下，由最小半径沉在最大的转头速度下，由最小半径沉降到最大半径所需要的时间。降到最大半径所需要的时间。K越小，离心能力越越小，离心能力越大大。(三三)、离心机和转头、离心机和转头Beckman LE-80K(Optimal系列)转头：SW28SW55Ti90超速离心机超速离心机植物生理学与生物化学国家重点实验室植物生理学与生物化学国家重点实验室仪器室离心机有的关配置仪器室离心机有的关配置落地式超速离心机 2台台式超速离心机 1+1台 落地式高速冷冻离心机 2台台式高速冷冻离心机 1台超速转头超速转头(rotors)配置配置转头名称转头名称离心管体积离心管体积最大相对速度最大相对速度(g)Ti9013.5 ml 548,000Type70.1 Ti10.4 ml388,000Type 70 Ti26.3 ml371,000SW32 Ti17 ml187,000Type 45 Ti70 ml235,000SW2828 ml141,000SW555 ml368,000NVT6511.2 ml402,000VTi5036.2 ml242,000TLA-120.10.5ul279,000SW2828,000rpm14,1000gSW5555,000rpm368,000gTi90Ti9090,000rpm90,000rpm695,000g695,000g台式超速离心机高速离心机高速离心机R22A2R22A222,000rpm22,000rpm51,200g51,200g50ml*6=300ml50ml*6=300mlR12A3R12A312,000rpm12,000rpm23,800g23,800g300ml*6=1,800ml300ml*6=1,800mlR10SR10S10,000rpm10,000rpm16,470g16,470g50ml*4 = 200ml50ml*4 = 200ml三、离心机和转头的维护三、离心机和转头的维护1.离心机安全操作离心机安全操作不过速运转不过速运转平衡运转平衡运转准确组装转头准确组装转头不使用带伤转头不使用带伤转头不使用过期转头不使用过期转头2.离心机的维护离心机的维护每次用毕，对于超速离心机，只需定期清洁每次用毕，对于超速离心机，只需定期清洁离心机内腔。离心机内腔。对于高速离心机，每次必须将内腔擦干，且对于高速离心机，每次必须将内腔擦干，且不能长期将转头置于转轴上，以免传感器受潮不能长期将转头置于转轴上，以免传感器受潮失灵。失灵。3.转头的维护转头的维护离心机转头，如果忽视其设置的精密程度和离心机转头，如果忽视其设置的精密程度和严格的使用方法，就会大大影响它的奉命。严格的使用方法，就会大大影响它的奉命。事实上，一个转头在承受一百万倍的大气压事实上，一个转头在承受一百万倍的大气压下，一克就相当于一吨的重量，若转头的表下，一克就相当于一吨的重量，若转头的表面有很细微的裂缝，对转头就会造成很大的面有很细微的裂缝，对转头就会造成很大的影响，此影响可能会超过转头原本设置所能影响，此影响可能会超过转头原本设置所能承受的范围。承受的范围。（1）维护转头寿命的）维护转头寿命的三个因素：三个因素：专门的设计和制造专门的设计和制造使用中的注意事项和合理的操作使用中的注意事项和合理的操作当损坏或因疲劳连续使用而产生当损坏或因疲劳连续使用而产生不安全时，转头必须停用不安全时，转头必须停用转头的设计与制造转头的设计与制造一般的生产厂家，在制造转头时，会进行一般的生产厂家，在制造转头时，会进行转头转头/马达系统的震动测试。它们会在一个特殊马达系统的震动测试。它们会在一个特殊构造的房间里进行非破坏性和破坏性试验，来构造的房间里进行非破坏性和破坏性试验，来检验转头的寿命。检验转头的寿命。引起离心机转头损坏的原因引起离心机转头损坏的原因金属疲劳化学腐蚀应力腐蚀金属疲劳金属疲劳转子在加速过程中，材料内部多次重复受到拉伸或松驰的交变引力的作用，引起材料结构细微变化，经过一定次数的交变引力循环，这些细微变化导致极细微的裂纹。化学腐蚀化学腐蚀由于所用的离心管不能承受介质的性质，或者离心管存放太久，老化后受不了强离心力的缘故，会造成离心管的破裂，样品渗漏到转头内。若没按规定程序操作，造成转头不密封，当抽真空时，转头内腔产生负压，也会样品渗漏，对转头产生化学腐蚀而严重影响转头的寿命。应力腐蚀应力腐蚀应力腐蚀是金属疲劳和化学腐蚀两者同时作用应力腐蚀是金属疲劳和化学腐蚀两者同时作用产生的结果。当转头某部分因受化学腐蚀或破产生的结果。当转头某部分因受化学腐蚀或破损后，该部分所承受的引力增大了，此种情况损后，该部分所承受的引力增大了，此种情况下，转头便会很容易毁坏。下，转头便会很容易毁坏。（2）转头操作的注意事项）转头操作的注意事项避免避免CsCl结晶结晶CsCl温度过低产生结晶，沉降就会胀破离心管，温度过低产生结晶，沉降就会胀破离心管，从而损坏转头。从而损坏转头。转头需加盖转头需加盖由于疏忽大意，勿将转头盖盖紧，或忘记加盖，由于疏忽大意，勿将转头盖盖紧，或忘记加盖，当转头运行时，离心腔内会产生空气旋涡使转当转头运行时，离心腔内会产生空气旋涡使转头浮起，转头离开转轴而发生意外。因此在仪头浮起，转头离开转轴而发生意外。因此在仪器启动时，应再检查转头盖是否已盖紧。器启动时，应再检查转头盖是否已盖紧。注意溶液密度对转头速度的限额注意溶液密度对转头速度的限额溶液密度大小对转头强度受力有很大关系，在进溶液密度大小对转头强度受力有很大关系，在进行密度梯度或等密度离心时，配置的介质密度必须低行密度梯度或等密度离心时，配置的介质密度必须低于说明书中标记的转头所能承受的最大密度。若高于于说明书中标记的转头所能承受的最大密度。若高于该密度，可用下列公式计算最大速度：该密度，可用下列公式计算最大速度：当采用塑料管戴硬铝帽、样品比重大于当采用塑料管戴硬铝帽、样品比重大于1.2，新的，新的最大速度转子最大转速最大速度转子最大转速(1.2/新的密度新的密度)1/2当采用不锈钢管戴硬铝帽，样品比重小于当采用不锈钢管戴硬铝帽，样品比重小于1.2，最，最大允许转速必须减少设定速度的大允许转速必须减少设定速度的15%，即最大允许速，即最大允许速度最大设定转速（度最大设定转速（115%）当采用不锈钢管及管帽、样品比重小于当采用不锈钢管及管帽、样品比重小于1.2时，最大设时，最大设定转速必须减少定转速必须减少25%（3）转头的保养）转头的保养转头的清洁转头的清洁所有的转头使用后必须用温水洗涤并干燥，如果必须使用去污剂，则不应使用碱性去污剂。转头干燥，涂油保养转头干燥，涂油保养严禁将转头浸泡在去污剂中。冲净后的转头必须干燥，通常在室温下将转头倒置自然干燥。转头外表可稍涂些硅脂保护表面，转头内壁腔可涂上硅油保护。密封圈密封圈转头盖与吊桶内壁的密封圈可使转头和离心管在密封的情况下运行，如果密封圈老化，转头内便因离心腔抽真空而形负压，使离心管破裂或渗漏损坏转头。因此，密封圈如有损坏，应及时更换，更换前应涂上真空脂，加强保护。超速盘的更换超速盘的更换为了保证转子的正常运行，使用前必须检测超速盘有否为了保证转子的正常运行，使用前必须检测超速盘有否磨损，转子使用后，将转子清洗倒放在实验桌上。当发磨损，转子使用后，将转子清洗倒放在实验桌上。当发现转子底部的超速盘损坏或磨损，必须立即更换。首先现转子底部的超速盘损坏或磨损，必须立即更换。首先将损坏的超速盘取下，然后用四氯化碳有机溶剂清洗干将损坏的超速盘取下，然后用四氯化碳有机溶剂清洗干净，再将备用的超速盘换上。净，再将备用的超速盘换上。转头寿命的折算转头寿命的折算一般是最大转速的次数。若转头动作已超过其寿命保证一般是最大转速的次数。若转头动作已超过其寿命保证期，在没有任何损伤的情况下，转头应按期，在没有任何损伤的情况下，转头应按90%折算后再折算后再继续使用。继续使用。四、离心机的事故四、离心机的事故正在旋转正在旋转后果后果五、离心技术在样品制备中的作用五、离心技术在样品制备中的作用分离活体生物：细胞、微生物、病毒分离活体生物：细胞、微生物、病毒细胞器：细胞核、细胞膜、线粒体细胞器：细胞核、细胞膜、线粒体生物大分子：核酸、蛋白质、酶、多聚物生物大分子：核酸、蛋白质、酶、多聚物Homogenate1,000g 5minSupernatantNuclei10,000g 15minSupernatantMitochondria100,000g 1hCytosolmicrosomes植物细胞膜的提取和纯化植物细胞膜的提取和纯化新鲜材料或冻存材料新鲜材料或冻存材料研磨研磨离心，离心，10000g,40min上清，上清，100000g,40-60min沉淀（沉淀（微粒体微粒体）悬浮，悬浮，二相法二相法离心，离心，100000g,40-60min沉淀（纯化的细胞膜组分）沉淀（纯化的细胞膜组分）检测检测：标志酶或磷钨酸染色法：标志酶或磷钨酸染色法猪脑微管蛋白的提取猪脑微管蛋白的提取1.取4-6个猪脑，用冷重蒸水冲洗，置于预冷的大培养皿中，除去表层脑膜、脑血管和多余的脂肪。2.将处理的猪脑转移至烧杯中，加入适量预冷的提取缓冲液，（100mmol/L MES-NaOH, pH6.9，2mmol/L EGTA，1mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT），使其体积400ml 左右，倒入组织匀浆机中匀浆6次，每次10秒。3.将匀浆液于高速离心机上离心，22000rpm，4，30min.4.上清液用四层纱布过滤，量滤液体积，加入等体积的聚合缓冲液（100mmol）同时加入ATP母液，使其终浓度为1mmol/L, 加入GTP母液，使其终浓度为0.015mmol/L。于37 水浴中1小时使微管蛋白聚合。5.完全聚合后的溶液于100,000g,30 离心1小时。6.去除上清液，加入适量的预冷提取缓冲液，加入GTP使其终浓度为0.1mmol/L，并轻轻敲开沉淀，使其在冰上解聚4060min。7.解聚后的微管蛋白溶液在100,000g，4 下离心20min.8. 用量筒量上清液体积，加入等体积的聚合缓冲液于上清，加入GTP使其终浓度为1mol/L，37 水浴中聚合4060min.9. 完成聚合后的溶液于100,000g， 37 下离心1小时。弃上清，储存沉淀于70 。白色杜鹃花