Immunolabeling techniqueImmunolabeling technique最新免疫标记技术 第一节第一节 免疫标记技术的基本概念免疫标记技术的基本概念一、免疫标记与标记免疫的概念二、常用的免疫标记物质最新免疫标记技术 免疫标记与免疫标记与标记免疫标记免疫免疫标记技术免疫标记技术：标记物与免疫活性物质的联接技术标记免疫技术标记免疫技术：以标记免疫物质检测相应靶物质的技术最新免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术 =抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性灵敏性灵敏性特异性特异性特异性特异性免疫标记技术的主要特点：免疫标记技术的主要特点：高特异性高特异性、高灵敏性高灵敏性免疫技术免疫技术+ 标记技术标记技术酶酶酶酶荧光素荧光素荧光素荧光素同位素同位素同位素同位素其它其它其它其它最新免疫标记技术常用的免疫标记物质常用的免疫标记物质类别 标记物 用途荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定 最新免疫标记技术 第第二二节节 标记免疫技术的分类标记免疫技术的分类一、按指示标记物质划分的类型二、按测定方式划分的类型三、按测定用途划分的类型最新免疫标记技术1、酶免疫技术2、荧光免疫技术3、放射免疫技术4、金免疫技术按指示标记物质划分的类型按指示标记物质划分的类型最新免疫标记技术1、均相型（homogenous）2、非均相型（heterogeneous）按测定方式划分的类型按测定方式划分的类型最新免疫标记技术均相型（均相型（homogenous）非均相型非均相型（heterogeneous）最新免疫标记技术1、免疫测定技术2、免疫组化技术按测定用途划分的类型按测定用途划分的类型最新免疫标记技术 第第三三节节 酶标记技术酶标记技术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与鉴定最新免疫标记技术常用标记方法常用标记方法1、常用酶 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP）2、标记方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法最新免疫标记技术戊二醛交联法戊二醛交联法 (一步法）一步法）抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶最新免疫标记技术戊二醛交联法（二步法）戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶最新免疫标记技术过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+ NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环最新免疫标记技术标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度最新免疫标记技术 酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验enzyme linked immunosorbent assay （ ELISA ）最新免疫标记技术ELISAELISA基本的实验过程基本的实验过程最新免疫标记技术ELISA技术的原理与方法技术的原理与方法间接法 夹心法 竞争法最新免疫标记技术间接法间接法最新免疫标记技术夹心法夹心法最新免疫标记技术竞争法竞争法最新免疫标记技术 第第四四节节 荧光标记技术荧光标记技术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化最新免疫标记技术常用标记方法常用标记方法1、荧光素的概念2、生物标记荧光素的要求3、常用荧光素标记原理与方法 最新免疫标记技术生物标记荧光素的要求生物标记荧光素的要求1、具有与蛋白质共价结合的能力2、荧光效率高3、能与背景物质形成鲜明对比4、不影响蛋白质的生物、免疫活性5、标记方法安全、简便6、标记物稳定，易保存最新免疫标记技术荧光抗体技术的原理与方法荧光抗体技术的原理与方法直接法间接法补体法双标记法 最新免疫标记技术直接法间接法补体法双标记法最新免疫标记技术标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离 目的：去除游离荧光素 方法：柱层析2、鉴定 抗体活性 标记物结合度 F/P比值的应用意义最新免疫标记技术 第第五五节节 放射性核素标记技术放射性核素标记技术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化最新免疫标记技术直接法（氯胺直接法（氯胺T T法）法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T最新免疫标记技术间接法（连接法）间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+ Na125I氯胺T125INSHPP最新免疫标记技术结合相游离相放射免疫分析法的原理与方法放射免疫分析法的原理与方法最新免疫标记技术常用标记方法常用标记方法1、常用放射性核素2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法） 间接法（连接法）最新免疫标记技术标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）应用意义最新免疫标记技术第六节第六节 胶体金标记免疫技术胶体金标记免疫技术 (金标法金标法) 胶体金是由氯化金与还原剂反应形成的一种胶体颗粒，具有吸附蛋白质的特性(可以标记Ag或Ab)； 胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的胶体金颗粒呈现酒红色。 胶体金标记免疫技术是将金颗粒光学检测的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合。最新免疫标记技术胶体金免疫法与胶体金免疫法与RIA、ELISA等方等方法相比法相比,有许多优点：有许多优点：1.它不需ELISA法中所要求的作用的底物和显色剂，使操作更简便;2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有效期长;4.灵敏度高。最新免疫标记技术免疫标记技术的比较免疫标记技术的比较 FIA ELISA RIA敏感性 较低 高 高特异性 高 高 高重复性 差 好 好检测对象 Ag/Ab Ag/Ab Ag最新免疫标记技术