蛋白质的分离、纯化、表征蛋白质的分离、纯化、表征第第 四四 章章一一 蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质 蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，在在一一定定的的溶溶液液pHpH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH时时，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，即即成成为为兼兼性性离离子子，净净电电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。 *蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离 大小( (一一) )根据化学组成测定最低相对分子质量根据化学组成测定最低相对分子质量公式: 最低相对分子质量最低相对分子质量= 铁的原子量铁的原子量 100 铁的百分含量铁的百分含量二二 蛋白质分子的大小与形状蛋白质分子的大小与形状 （二）渗透压法测定相对分子质量（二）渗透压法测定相对分子质量公式:R:气体常数T:绝对温度C:溶质浓度(g/m3)实际是测定几个不同浓度的渗透压。(三三) 蛋白质的扩散和扩散系数蛋白质的扩散和扩散系数n n扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。菲克定律一：菲克定律一： dm=-DA dcdm=-DA dc dt dx dt dxD D：扩散系数。当浓度梯度为一个单位时，在一秒：扩散系数。当浓度梯度为一个单位时，在一秒内通过内通过1 1厘米厘米2 2面积所扩散的溶质量。面积所扩散的溶质量。n n菲克定律二：测定扩散系数n n沉降速度法沉降速度法 Mr= Mr= R R TsTs D(1- D(1-) : :蛋白质的偏微比容蛋白质的偏微比容 S S：沉降系数：沉降系数S S值值 ：溶剂密度：溶剂密度 D D：扩散系数：扩散系数 ( ( ( (四四四四) ) ) ) 沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n n沉降平衡法 Mr= 2R Tdln(c2/c1) (1-)2(x22-x21) W:转头的角速度 c2，c1：离转中心x1，x2处的蛋白质浓度( ( ( (五五五五) ) ) ) 凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量（六）（六）（六）（六）SDSSDSSDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定 蛋白质分子质量蛋白质分子质量蛋白质分子质量蛋白质分子质量n n每两个氨基酸残基结合一SDS分子后果： 1 掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别。 2 改变了蛋白质单体分子的构象。公式：形状形状n nX射线晶体结构分析三三 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 (一一)胶体性质胶体性质蛋蛋白白质质属属于于生生物物大大分分子子之之一一，分分子子量量可可自自1万万至至100万万之之巨巨，其其分分子子的的直直径径可可达达1100nm，为胶粒范围之内。为胶粒范围之内。 * * 蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉（二）蛋白质的沉淀（二）蛋白质的沉淀在在一一定定条条件件下下，蛋蛋白白疏疏水水侧侧链链暴暴露露在在外外，肽肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变变性性的的蛋蛋白白质质易易于于沉沉淀淀，有有时时蛋蛋白白质质发发生生沉沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。 沉淀方法沉淀方法*盐盐析析(salt precipitation)是是将将硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液，使使蛋蛋白白质质表表面面电电荷荷被被中中和和以以及及水水化化膜膜被被破破坏坏，导导致致蛋蛋白白质质沉淀。沉淀。 *有机溶剂深沉法有机溶剂深沉法 如乙醇如乙醇,丙酮等沉淀。丙酮等沉淀。 *重金属盐沉淀法析重金属盐沉淀法析 金属离子金属离子 *生物碱试剂和某些酸类沉淀法析生物碱试剂和某些酸类沉淀法析 生物碱生物碱 *加热变性沉淀法析加热变性沉淀法析 加热加热 n n前处理n n组分级处理n n细分级处理四四 蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的一般原则 n n根据分子大小不同根据分子大小不同透析、超过滤、梯度离心、凝胶过滤透析、超过滤、梯度离心、凝胶过滤n n根据溶解度差别根据溶解度差别等电点沉淀、等电点沉淀、PHPH控制、蛋白质盐溶和盐析、有控制、蛋白质盐溶和盐析、有机溶剂、温度机溶剂、温度n n根据电荷不同根据电荷不同电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦、层析聚焦、离子交换层析电聚焦、层析聚焦、离子交换层析五五 蛋白质分离纯化的方法蛋白质分离纯化的方法 n n选择性吸附的纯化方法羟磷灰石层析、疏水作用层析n n对配体的特异生物学亲和力的纯化方法n n高效液相层析和快速蛋白质液相层析1 几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质，常用于蛋白质分子量的测定。分子量的测定。*等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技是蛋白质组学研究的重要技术。术。2 层析层析层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法* * 离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。质不同进行分离。* * 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，又称分子筛层析，利用利用各各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分子大小不同分离。目目 录录目目 录录3 超速离心超速离心* * 超超速速离离心心法法(ultracentrifugation)既既可可以以用用来来分分离离纯纯化化蛋蛋白白质质也也可可以以用用作作测测定定蛋蛋白质的分子量。白质的分子量。 *蛋蛋白白质质在在离离心心场场中中的的行行为为用用沉沉降降系系数数(sedimentation coefficient, S)表表示示,沉沉降降系数与蛋白质的密度和形状相关系数与蛋白质的密度和形状相关 。因因为为沉沉降降系系数数S大大体体上上和和分分子子量量成成正正比比关关系系，故故可可应应用用超超速速离离心心法法测测定定蛋蛋白白质质分分子子量量，但但对对分分子子形形状状的的高高度度不不对对称称的的大大多多数数纤纤维状蛋白质不适用。维状蛋白质不适用。六六 蛋白质含量测定与纯度鉴定蛋白质含量测定与纯度鉴定n n含量测定凯氏定氮法、双缩脲法、凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-Folin-酚试剂法等酚试剂法等n n纯度鉴定 电泳、沉降、电泳、沉降、HPLCHPLC、溶解度等、溶解度等