Chapter 1. DNA Structure and Chemistry a). Evidence that DNA is the genetic information i). DNA transformation ii). Transgenic experiments iii). Mutation alters phenotypei). DNA transformation: in vivo experimentMice are injected either with Type R, non-virulentStreptococcus or with heat-killed, virulent Type S cells.The mice are healthyX Mice are injected with both Type R, non-virulent andheat-killed, Type S Streptococcus DNA carrying genes fromthe virulent, heat-killed cellstransforms the non-virulentbacterial cells, making themlethal to the miceDNA transformation: in vitro experimentType R cellsType R coloniesType S cellsType S coloniesMixture ofType R and Type ScoloniesType R cells+ DNA fromType S cellsii). Transgenic experimentsInjected into nucleus of a fertilized mouse egg Egg implanted into uterusof surrogate mother mouse Mother mouse gives birth to transgenic mouseListen to audio descriptions of:transgenic*knockout*mouse model*(requires RealPlayer).Mouse with growthhormone transgeneNormal mouseGenotype:An organisms genetic constitution.Phenotype:The observed characteristics of an organism,as determined by the genetic makeup(and the environment).DNA from Type S cells (thus conferring the Type S genotype)transformed Type R cells into cells having the Type S phenotype iii). Mutation alters phenotype Phenotypic differences between individualsare due to differences between their genes These differences have arisen by mutation of DNAover many thousands of yearsb). Structure of DNA chemistry Structure (polynucleotide strand) Structure of the DNA double helix supercoiledThymine (T)Guanine (G)Cytosine (C)Adenine (A)i). Structure of the bases, nucleosides, and nucleotidesPurinesPyrimidines5-Methylcytosine (5mC)structure of deoxyadenosineNomenclaturePurinesadenineadenosineguanineguanosinehypoxanthineinosinePyrimidinesthyminethymidinecytosinecytidine +ribose uraciluridine Nucleoside NucleotideBase +deoxyribose +phosphate polynucleotide chain 3,5-phosphodiester bondii). Structure of the DNA double helixl DNA的一级结构的一级结构 DNA碱基排列顺序（生物学定义）碱基排列顺序（生物学定义） 由由A、T、G、C四种脱氧核苷酸组成，通过四种脱氧核苷酸组成，通过3-5-磷磷酸二酯键连接成的线形结构。（化学定义）酸二酯键连接成的线形结构。（化学定义） 方向：方向：5 3 阅读方式（书写方式）：阅读方式（书写方式）： 5 3 一级结构决定一级结构决定DNA的高级结构，决定的高级结构，决定DNA的功能。的功能。 DNA由脱氧核糖核酸组成，2-H，对碱具有耐受性，PH在11.5条件下，一级结构仍不被破坏； RNA由于2-OH，对碱不具有耐受性，易被碱水解。DNA一级结构据功能分两类：一级结构据功能分两类： 功能较明确的序列功能较明确的序列 编码序列：与代谢有关的序列编码序列：与代谢有关的序列 调控蛋白（阻遏蛋白）调控蛋白（阻遏蛋白） 调控序列调控序列 （基因表达水平由调控蛋白和调控序列决定（基因表达水平由调控蛋白和调控序列决定） 功能不明确的序列功能不明确的序列 DNA一级结构的分析一级结构的分析 1.DNA的分离，提取的分离，提取 材料的选择材料的选择 物种、组织的选择物种、组织的选择 组织匀浆组织匀浆 细胞分散、破碎细胞分散、破碎 破碎细胞破碎细胞 SDS表面活性剂表面活性剂 除蛋白除蛋白 蛋白酶蛋白酶K 酚、氯仿抽提酚、氯仿抽提 除除RNA RNA酶酶 LiCl 沉淀沉淀 DNA回收回收 乙醇、异丙醇沉淀乙醇、异丙醇沉淀纯度鉴定：纯度鉴定： 电泳电泳 常用琼脂糖凝胶电泳，也用聚丙烯酰常用琼脂糖凝胶电泳，也用聚丙烯酰胺凝胶电泳，用溴化乙锭（胺凝胶电泳，用溴化乙锭（EB）染色，紫外灯染色，紫外灯下检测。下检测。 检测量可达检测量可达ug，ng级级 检测信息：检测信息：DNA的有无的有无 DNA的大小，的大小， 构象构象 纯度纯度 紫外吸收法（紫外吸收法（260nm） OD260 - 决定决定DNA的量的量 OD280 - 决定决定Protein的量的量 OD260/280 =1.8 纯样品纯样品 1.8 不纯不纯 =2.0 RNA（纯）纯） 2.限制性内切酶图谱限制性内切酶图谱 限制性内切酶的发现限制性内切酶的发现 定义：特异性的识别某些核酸序列，并将切定义：特异性的识别某些核酸序列，并将切断的酶（双链）。断的酶（双链）。 特性：特性：识别序列有对称性（回文结构）识别序列有对称性（回文结构） 5-GGTACC-3 3-CCATGG-5 识别序列一般为识别序列一般为4848个核苷酸；个核苷酸； 如果碱基被修饰，则不能被识别；如果碱基被修饰，则不能被识别； 切口：粘性末端和平口末端切口：粘性末端和平口末端 应用于应用于DNA重组、重组、DNA结构分析（突变、缺失）结构分析（突变、缺失） 遗传图谱分析；遗传图谱分析； 粘性末端粘性末端 平口末端平口末端 5-ATCGAT-3 5-ATCGAT- 3 5-ATC GAT- 3 3-TAGCTA-5 3-TAGCTA-5 3-TAG CTA- 5 5-粘性末端粘性末端 3- 粘性末端粘性末端 5-NNG3 5 pAATTCNN-3 5-NNCTGCA3 5 pGNN-3 3-NNCTTAAp5 3 GNN-5 3-NNGp5 3 ACGTCNN-5DNA物理图谱：物理图谱： 定义定义:指指DNA链的限制性酶切片段的排列顺序链的限制性酶切片段的排列顺序,即酶切片段在即酶切片段在DNA链上的定位。链上的定位。 制作制作意义意义: 基因定位基因定位 基因重组、剪接基因重组、剪接 DNA测序测序 PCR技术技术 定义定义 体外基因扩增法，在体外（试管、反应体外基因扩增法，在体外（试管、反应管中）将要研究的目的基因或管中）将要研究的目的基因或DNA片段在短片段在短时间内扩增上百万倍，称为时间内扩增上百万倍，称为DNA聚合酶链式聚合酶链式反应（反应（PCR Polymerase Chain Reaction）发展简史发展简史 1971年年Korana最早提出核酸体外扩增的最早提出核酸体外扩增的设想：设想：“经过经过DNA变性，与合适的引物杂交，变性，与合适的引物杂交，用用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆便可克隆tRNA基因基因”。 1985年美国年美国PE-Cetus公司人类遗传研究公司人类遗传研究室的室的Mullis 发明了聚合酶链反应。其原理类发明了聚合酶链反应。其原理类似于似于DNA的体内复制，只是在试管中进行的体内复制，只是在试管中进行DNA的体外合成。的体外合成。 Mullis最初使用的最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶聚合酶 I 的的Klenow片段，其缺点是：片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，酶不耐高温，引物链延伸反应在引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配。基错配。 1988年初，年初，Keohanog改用改用T4 DNA聚合聚合酶进行酶进行PCR 。 1988年年Saiki 等从温泉中分离的一株水生等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种中提取到一种耐热耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：聚合酶。此酶具有以下特点：耐耐高温，在高温，在70下反应下反应2h后其残留活性大于后其残留活性大于原来的原来的90%，在，在93下反应下反应2h后其残留活后其残留活性是原来的性是原来的60%，在，在95下反应下反应2h后其残后其残留活性是原来的留活性是原来的40%。 在热变性时不会在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度增加了扩增长度(2.0Kb)。将此酶命名为将此酶命名为Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。 此酶的发现使此酶的发现使PCR广泛的被应用。广泛的被应用。 基本原理基本原理 第一步第一步 “加热变性加热变性”：高温下使：高温下使DNA的双的双链解开成为两条单链链解开成为两条单链DNA 分子；分子； 第二步第二步 “退火退火” ：引物附着到模板：引物附着到模板DNA两两侧；侧； 第三步第三步 “延伸延伸”：DNA聚合酶在适当的反聚合酶在适当的反应温度下促使核苷酸依次按与模板碱基互补应温度下促使核苷酸依次按与模板碱基互补配对原则，在引物配对原则，在引物3端一个个地连接上去，端一个个地连接上去，直至形成一个完整的直至形成一个完整的DNA分子。分子。 PCR反应所需成分：反应所需成分： DNA模板模板 引物（前、后）引物（前、后） dNTP（dATP、 dTTP 、dCTP 、 dGTP ） 反应缓冲液反应缓冲液 Mg+ DNA聚合酶聚合酶 反应要求引物的量远远大于模板的量，反应要求引物的量远远大于模板的量， Why？ 保证引物与模板配对的可能性大于模保证引物与模板配对的可能性大于模板与模板配对的可能性。板与模板配对的可能性。 特点：特点： a. 扩增产物的长度及位置由引物扩增产物的长度及位置由引物 确定；确定； b.特异性（取决于引物的特异性）特异性（取决于引物的特异性） c.灵敏性（扩增效率）灵敏性（扩增效率） 理论上理论上: 2n （230=109） 实际实际 : 106 107改进的改进的PCR技术技术 逆转录逆转录 PCR（retrotranscription PCR, RT PCR） 锚定锚定 PCR（anchored PCR） 应用：应用： PCR产物的克隆；产物的克隆； 检测（疾病、突变、育种、法医鉴检测（疾病、突变、育种、法医鉴 定、生物进化、分类等）定、生物进化、分类等） 多态性分析多态性分析 常见问题：污染（试剂、实验室、样品）常见问题：污染（试剂、实验室、样品） 酶酶 DNA测序测序(Sequence) 基本原理基本原理: 先进行末端标记，作为长度先进行末端标记，作为长度参考位置，把核苷酸的序列测定参考位置，把核苷酸的序列测定 长度长度测定。测定。1.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法 1977年，英国剑桥生化学家年，英国剑桥生化学家Sanger 等人等人发明。发明。 Sanger首先提出首先提出“加减法加减法”，后又，后又对其进行了改进对其进行了改进双脱氧链终止法双脱氧链终止法 原理：利用原理：利用DNA聚合酶聚合酶1的聚合反应，的聚合反应，在反应混合物中加入模板、放射性标记在反应混合物中加入模板、放射性标记的引物，的引物，DNA聚合酶聚合酶1和四种和四种dNTP，另另外加入一定比例的外加入一定比例的2, 3-ddATP, 当合成当合成时时ddATP参与后，链将不能再延伸而停参与后，链将不能再延伸而停止。止。 注意：注意： 样品中加入一定比例的样品中加入一定比例的ddNTP。 dNTP / ddNTP = 1：50 = 1：100 2. Maxam-Gilbert化学修饰法化学修饰法 1977年，由美国哈佛大学年，由美国哈佛大学Maxam和和Gilbert发明。发明。 原理：用化学试剂处理具末端放射性标记原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的的DNA片段，造成碱基的特异性修饰和切断，片段，造成碱基的特异性修饰和切断，产生一组具有各种不同长度的产生一组具有各种不同长度的DNA链的混合链的混合物，经电泳分离和放射性自显影后，便可读物，经电泳分离和放射性自显影后，便可读出待测出待测DNA片段的核苷酸序列。片段的核苷酸序列。通常用的化学试剂是硫酸二甲酯和肼通常用的化学试剂是硫酸二甲酯和肼 其作用原理是：其作用原理是：1.破坏糖环相连的碱基，破坏糖环相连的碱基，将碱基从糖环上切除；将碱基从糖环上切除；2. 进一步从这一进一步从这一位置将磷酸二酯键断裂。位置将磷酸二酯键断裂。 DNA序列分析的自动化序列分析的自动化 传统的测序方法通用、有效，但操作传统的测序方法通用、有效，但操作步骤繁琐、效率低、速度慢。步骤繁琐、效率低、速度慢。DNA序列分析的自动化序列分析的自动化 “分析反应分析反应”自动自动化化 “读片过程读片过程”自动自动化化 1. 标记物标记物四甲基若丹明四甲基若丹明 tetramethylrhodamine 2. 读取读取在电泳凝胶的侧面，固定一在电泳凝胶的侧面，固定一个激光通道小孔，安装荧光信号接收器。个激光通道小孔，安装荧光信号接收器。 3. 双脱氧法双脱氧法ddNTP分别用四种不同分别用四种不同颜色的荧光标记。颜色的荧光标记。 毛细管测序毛细管测序 （高通量）（高通量） DNA突变分析突变分析 DNA RNA Protein 性状性状碱基改变后，或会影响蛋白质的形成，碱基改变后，或会影响蛋白质的形成， 关键部位关键部位 或无改变或无改变 非关键部位非关键部位DNA结构变化：点突变、缺失、扩增结构变化：点突变、缺失、扩增1.RFLP限制性内切酶多态性分析限制性内切酶多态性分析Restriction Fragment Length Polymorphisms制作方法：酶切制作方法：酶切电泳电泳（转膜（转膜杂杂 交）交）分析分析2.AFLPAmplified Fragment Length Polymorphism扩增片段长度多态性分析扩增片段长度多态性分析制作方法：酶切制作方法：酶切加接头加接头PCR电泳电泳分析。分析。RFLP、AFLP用于突变分析的局限性：用于突变分析的局限性： 突变必须发生于酶切位点区域，否则检突变必须发生于酶切位点区域，否则检测不到。测不到。3.SSCPSingle strand conformation polymorphism 单链构象多态性分析单链构象多态性分析 基本原理：单链基本原理：单链DNA片段呈复杂的空间片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中迁移分子在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率不同。率不同。基本过程是基本过程是:PCR扩增靶扩增靶DNA; PCR扩增扩增 产物变性；产物变性； 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳; 显显 色分析结果色分析结果. 若发现单链若发现单链DNA带迁移率与正常对带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构照的相比发生改变，就可以判定该链构 象发生改变，进而推断该象发生改变，进而推断该DNA片段中有片段中有碱基突变碱基突变. 局限性：只有突变位点影响其空间构象局限性：只有突变位点影响其空间构象 才能被检出来。才能被检出来。 检出率：检出率：70%4.变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) DNA片段在变性剂梯度聚丙烯酰胺凝胶片段在变性剂梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝中电泳，凝 胶中自上而下所含变性剂浓度呈胶中自上而下所含变性剂浓度呈梯度增加。梯度增加。DNA片段在进入变性剂某一浓度片段在进入变性剂某一浓度时，此浓时，此浓 度下度下DNA片段在最低温度解链区域片段在最低温度解链区域解链解链(Tm值值)，此时，此时DNA分子成分枝状分子成分枝状 结构，结构，它使它使DNA分子在胶中的移动减慢。如果梯度分子在胶中的移动减慢。如果梯度条件选择恰当，因单个碱基变化使不同的条件选择恰当，因单个碱基变化使不同的DNA片段在凝胶中的不同位置分叉片段在凝胶中的不同位置分叉，随后随后DNA片段移动减慢，从而使笪片段移动减慢，从而使笪DNA片段片段 最终最终分离开来。分离开来。 变性梯度胶凝电泳能够将具有单个碱基变性梯度胶凝电泳能够将具有单个碱基差别的差别的DNA分子分离开来。点突变检出率可分子分离开来。点突变检出率可达达100%，但操作复杂，技术要求较高。，但操作复杂，技术要求较高。DNA携带的遗传信息：携带的遗传信息： 负责蛋白质、氨基酸组成的信息；负责蛋白质、氨基酸组成的信息； 基因选择性表达的信息。基因选择性表达的信息。DNA一级结构的意义：一级结构的意义： 蕴藏遗传信息；蕴藏遗传信息；决定决定DNA的二级结构和空间结构；的二级结构和空间结构； 一级结构是研究二级结构和空间结构的一级结构是研究二级结构和空间结构的基础；一级结构中得到的许多信息需要用二基础；一级结构中得到的许多信息需要用二级结构和空间结构来解释；大量遗传特征需级结构和空间结构来解释；大量遗传特征需从二级结构和空间结构上加以发掘；二级结从二级结构和空间结构上加以发掘；二级结构和空间结构将成为弄清生命遗传奥秘的主构和空间结构将成为弄清生命遗传奥秘的主要领域之一。要领域之一。Structure of the DNA double helix i). Watson and Crick model 主链：两条反向平行的长链主链：两条反向平行的长链 碱基配对：碱基配对：意义：二级结构的稳定，利于储存更意义：二级结构的稳定，利于储存更 多信息；复制的可靠性，使遗多信息；复制的可靠性，使遗 传信息传递；基因转录真实性传信息传递；基因转录真实性 的保证的保证;反义反义RNA的调控作用；的调控作用； 分子生物学的操作基础。分子生物学的操作基础。 大、小沟：大、小沟： 形成原因：两条主链骨架不在直径上，形成原因：两条主链骨架不在直径上， 碱基与主链的键偏离直径；碱基与主链的键偏离直径； 意义：意义：“信息识别的窗口信息识别的窗口” 。 蛋白质只有在沟内才能接触到不蛋白质只有在沟内才能接触到不 同的碱基序列，呈现出蛋白质与同的碱基序列，呈现出蛋白质与 双链双链DNA作用的特异性。作用的特异性。螺距：螺距：3.4nm 每每10对核苷酸绕轴一周对核苷酸绕轴一周 意义：增加信息存储空间，意义：增加信息存储空间， 增加碱基信息的远距离传递增加碱基信息的远距离传递.l维持双螺旋结构的作用力维持双螺旋结构的作用力 氢键氢键 疏水作用疏水作用 碱基堆积力碱基堆积力 范德华力范德华力 磷酸基的负电荷静电斥力磷酸基的负电荷静电斥力 碱基分子内能碱基分子内能Stacking interactionsCharge repulsionCharge repulsion DNA结构的不均一性结构的不均一性 反向重复序列（回文结构）反向重复序列（回文结构） 意义：信号识别；意义：信号识别； 富含富含A、T序列序列 意义：易于解链，与调控序意义：易于解链，与调控序 列有关；列有关； 碱基排列顺序碱基排列顺序 DNA二级结构的多样性二级结构的多样性 类型：右手螺旋类型：右手螺旋A、B、C、D、E 左手螺旋左手螺旋Z 影响影响DNA构象的因素：构象的因素： 相对湿度相对湿度 盐离子的类型和浓度盐离子的类型和浓度 碱基组成碱基组成 ( 内在内在 ) 是否与蛋白质结合是否与蛋白质结合常见构象的结构参数常见构象的结构参数大沟、小沟的变化：大沟、小沟的变化： A型：大沟极深（型：大沟极深（小沟小沟5倍），小沟倍），小沟宽而浅；宽而浅； B型：大沟宽而深，小沟窄而浅；型：大沟宽而深，小沟窄而浅； Z型：型： 大沟几乎没有，小沟窄而深。大沟几乎没有，小沟窄而深。 DNA构象家族构象家族 同一种构型中各种构象的总和构成一同一种构型中各种构象的总和构成一个构象家族。个构象家族。 B-DNA 28420 平均平均 360 A-DNA 16440 平均平均 290 概念：概念： 螺旋桨扭角螺旋桨扭角 ( 螺旋桨效应螺旋桨效应 )螺旋桨扭角螺旋桨扭角:一个碱基对中的一个碱基对中的两个碱基并两个碱基并不在同一平面上，而是两个碱基平面相不在同一平面上，而是两个碱基平面相对长轴各自向相反方向扭转，如果沿碱对长轴各自向相反方向扭转，如果沿碱基对的长轴看去，靠近的碱基沿碱基对基对的长轴看去，靠近的碱基沿碱基对长轴顺时针方向扭转为正长轴顺时针方向扭转为正, ,逆时针方向扭逆时针方向扭转为负。研究发现靠近的碱基总是顺时转为负。研究发现靠近的碱基总是顺时针方向扭转，螺旋桨扭角总是正值。针方向扭转，螺旋桨扭角总是正值。A-DNA15 ，B-DNA12 , 个别情个别情况可以低至况可以低至3 , 高至高至25 . 螺旋桨效应后果：螺旋桨效应后果： 1.改善同一主链中相邻碱基间的堆积改善同一主链中相邻碱基间的堆积作用，增加碱基之间的重叠面积；作用，增加碱基之间的重叠面积； 2.使相邻碱基对中嘌呤环过份接近，使相邻碱基对中嘌呤环过份接近，产生抵捂。产生抵捂。 大沟抵捂大沟抵捂 嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶 小沟抵捂小沟抵捂 嘧啶嘧啶嘌呤嘌呤解救方法：增加抵捂部位碱基转角；解救方法：增加抵捂部位碱基转角； 减少螺旋扭角。减少螺旋扭角。 概念：概念： 碱基倾角：碱基平面与垂直于螺旋碱基倾角：碱基平面与垂直于螺旋 轴平面间的夹角。轴平面间的夹角。 碱基转角：两相邻碱基对平面间的碱基转角：两相邻碱基对平面间的 夹角。（假想）夹角。（假想） 碱基的旋转角（螺旋扭角）碱基的旋转角（螺旋扭角） 螺旋桨扭角螺旋桨扭角 DNA supercoiled 超螺旋结构：双螺旋基础上进一步盘绕形成的螺超螺旋结构：双螺旋基础上进一步盘绕形成的螺旋结构，正常的旋结构，正常的DNA双螺旋由于解旋或增旋产生双螺旋由于解旋或增旋产生张力，促使张力，促使DNA内部原子位置重排，导致内部原子位置重排，导致DNA分分子本身发生卷曲。子本身发生卷曲。 L = T + WL：连环数，一条链绕另一条链的次数；：连环数，一条链绕另一条链的次数；T:扭转数，只标准扭转数，只标准B型型DNA落悬殊；落悬殊；W为超螺旋数为超螺旋数 =（L-LoL-Lo）/ Lo/ Lo为超螺旋密度。为超螺旋密度。超螺旋结构的意义超螺旋结构的意义：与与DNADNA复制、转录和复制、转录和 调控有关调控有关。超螺旋结构的改变超螺旋结构的改变 细胞中由细胞中由拓扑异构酶拓扑异构酶作用改变超螺旋作用改变超螺旋数。数。 拓扑异构酶：拓扑异构酶： 类：类： 类：类： 超螺旋的性质及超螺旋数的测定：超螺旋的性质及超螺旋数的测定： 1.碱性条件下，沉降速度增大；碱性条件下，沉降速度增大； 2.电泳速度加大，变性温度提高；电泳速度加大，变性温度提高； 3.在在CsCl中密度梯度离心速度变快；中密度梯度离心速度变快； 4.超螺旋的测定超螺旋的测定 DNA的变性与复性的变性与复性 DNA的变性的变性 1.概念：双链概念：双链单链（分子间）单链（分子间） 比较：比较：RNA变性（分子内）变性（分子内） Denaturation of DNAA-T rich regions denature firstCooperative unwinding of the DNA strandsExtremes in pH or high temperature2.理化性质的变化理化性质的变化 粘性下降粘性下降 沉降速度变慢沉降速度变慢 增色效应增色效应 （Tm） hyperchromicityThe absorbance at 260 nm of a DNA solution increases when the double helix is melted into single strands.260AbsorbanceSingle-strandedDouble-stranded2203003. 影响变性的因素：影响变性的因素： 碱基组成碱基组成 Tm = 69.34 + 0.41（G + C）% Tm值一般在值一般在8590OC 变性温度：最低变性温度：最低69.3OC 最高最高110.3OC 离子强度离子强度 高盐利于稳定，低盐利于变性高盐利于稳定，低盐利于变性 DNA的组成（纯度）的组成（纯度） DNA的长度的长度 温度（温度（Tm） 变性剂变性剂Electron micrograph of partially melted DNA A-T rich regions melt first, followed by G-C rich regionsDouble-stranded, G-C rich DNA has not yet meltedA-T rich region of DNAhas melted into asingle-stranded bubble DNA的复性的复性 1.定义：单链定义：单链双链双链 复性是一个较慢的过程，变性、复性是一个较慢的过程，变性、复性不断平衡的过程。复性不断平衡的过程。2.复性的条件：复性的条件： 足够高的温度；足够高的温度； 足够高的离子强度；足够高的离子强度； 足够长的时间。足够长的时间。 复性是一个配对、解链，再配对、复性是一个配对、解链，再配对、再解链再解链不断重复的过程，以至找不断重复的过程，以至找到完全的配对。到完全的配对。 3.影响复性的因素：影响复性的因素： 分子组成；分子组成； DNA的浓度；的浓度； DNA的长度；的长度； 温度；温度； 阳离子浓度；阳离子浓度； 变性剂。变性剂。 复性的标准条件复性的标准条件： 400bp长度的长度的DNA片段，片段， 在在Tm-25OC下，下， 离子强度为离子强度为0.18M钠盐下，钠盐下， 加变性剂时的复性温度加变性剂时的复性温度42OC 不加变性剂时的复性温度不加变性剂时的复性温度68OC 4.复性动力学曲线复性动力学曲线 复性过程是一个双分子过程，复性过程是一个双分子过程， 2ssDNAdsDNA, 动力学微分方程：动力学微分方程： dc/dt=-kc2 当当t=0时，时，CCo 积分积分C/Co=1/1+k Co t, 当当C/Co=1/2 时时(即复性至一半时即复性至一半时) Cot1/2=1/ k Co t的的应用应用: 1.据据Cot1/2推算推算DNA的长度的长度; 2.推算推算DNA序列重复次数及序列重复次数及DNA的最的最小分子量。小分子量。推算推算DNA序列重复次数及序列重复次数及DNA的最小分子量的最小分子量设：总DNA为X,则有：P,m,n分别为3个组分的拷贝数px 4.2x107=53% Xmx2.2x105=27%Xnx1.6x102=20%X(px 4.2x107)/(mx2.2x105)=53/27m=102p(px 4.2x107)/(nx1.6x102)=53/20n=105p如果p为1,则：X=4.2x107xp+2.2x105xm+1.6x102xn =4.2x107x+2.2x105x102+1.6x102x105=8x107分子杂交技术分子杂交技术 1.分子杂交的原理分子杂交的原理 将标记的将标记的DNA或或RNA分子与待检测的分子与待检测的靶靶DNA或或RNA一起变性一起变性, 复性复性,标记分子标记分子与靶分子形成杂交双链与靶分子形成杂交双链, 通过检测标记通过检测标记分子的标记信号分子的标记信号,即可检测靶分子的存在。即可检测靶分子的存在。2.2.研究进展：研究进展： 19611961年年HallHall等人建立了液相杂交等人建立了液相杂交 19621962年年BoltonBolton等人固相杂交建立等人固相杂交建立 原位杂交，斑点杂交原位杂交，斑点杂交 3. 固相杂交的操作程序固相杂交的操作程序靶分子的处理及固定靶分子的处理及固定 检测分子（探针）的制备检测分子（探针）的制备 杂交杂交 洗脱（去除非特异性结合的探针分子）洗脱（去除非特异性结合的探针分子） 检测探针分子的存在检测探针分子的存在 信息分析信息分析1.靶分子的处理及固定靶分子的处理及固定 a.DNA（RNA）的分离纯化；的分离纯化； b.DNA（RNA）处理处理 酶切酶切 电泳电泳 转移转移 交链交链 纸塔转膜纸塔转膜2.标记探针标记探针 分子探针（分子探针（prob）在分子杂交中，在分子杂交中，通过标记后与靶分子结合，并检测靶分通过标记后与靶分子结合，并检测靶分子存在性的分子（子存在性的分子（DNA、RNA）。）。 DNADNA DNARNA RNARNA ProteinProtein 标记方法：标记方法： 同位素标记同位素标记 P P3232、S S3535 生物素生物素 非同位素标记非同位素标记 地高辛地高辛 荧光荧光 P P32 32 标记标记S S35 35 标记标记同位素标记：同位素标记： 末端标记末端标记 5端标记端标记 3端标记端标记 中间标记中间标记缺口平移法缺口平移法 随机引物法随机引物法缺缺口口平平移移法法随随机机引引物物法法生物素标记生物素标记地高辛标记地高辛标记RNA标记3.杂交杂交 a.预杂交预杂交 （避免或尽量减少非特异（避免或尽量减少非特异 性的结合）性的结合） b.杂交杂交 预杂交液中加入适量探针；预杂交液中加入适量探针； 温浴温浴20小时。小时。 预杂交液：不加入探针预杂交液：不加入探针 杂交液：加入探针杂交液：加入探针 4.洗脱洗脱 目的：除去非特异性结合的目的：除去非特异性结合的 探针分子。探针分子。 一般用低盐洗脱液洗杂交膜。一般用低盐洗脱液洗杂交膜。 （SSC+SDS） 2 x SSC 1x SSC 0.5 x SSC 0.1 x SSC 离子强度越低，洗脱强度越大。离子强度越低，洗脱强度越大。 5.检测检测 采用与标记物相对应的检测方法。采用与标记物相对应的检测方法。 同位素同位素放射性自显影放射性自显影根据不同的根据不同的 酶酶酶联免疫酶联免疫标记物标记物 荧光荧光荧光扫描荧光扫描 常见的几种杂交方法常见的几种杂交方法 1. Southern 杂交杂交 DNADNA 靶分子（核靶分子（核DNA） 酶切、电泳酶切、电泳 分离分离DNA 转膜转膜 杂交、检测杂交、检测 检测信息：检测信息： 用于检测基因组用于检测基因组DNA。（。（DNA水平）水平） 例如：转基因后目的基因是否转入；例如：转基因后目的基因是否转入； RFLP是否存在靶分子；是否存在靶分子； 是否有突变。是否有突变。2. Northern 杂交杂交 DNARNA 靶分子（靶分子（RNA） 变性电泳变性电泳 分离分离RNA 转膜转膜 杂交、检测杂交、检测 Northern ：RNA水平的变化水平的变化基因表达基因表达 DNA RNA 检测信息：有无表达；检测信息：有无表达； 表达强弱；表达强弱； 分子大小。分子大小。 Southern Northern 3.Western 杂交杂交 （ProteinProtein） 提取蛋白质提取蛋白质 电泳（电泳（SDS） 转膜转膜 免疫检测免疫检测 检测信息：基因在蛋白质水平上的表检测信息：基因在蛋白质水平上的表 达（有无、强弱）达（有无、强弱） 蛋白质的分子量（大小）蛋白质的分子量（大小） 4.斑点杂交斑点杂交 Dot-bloding DNA、RNA直接点膜，进行杂交。直接点膜，进行杂交。 DNA：不同物种、不同个体间的比较；不同物种、不同个体间的比较； RNA：表达的强弱。表达的强弱。 5. 原位菌落杂交原位菌落杂交 主要用于文库筛选，寻找目的基因。主要用于文库筛选，寻找目的基因。 基因文库基因文库 基因组文库基因组文库 cDNA文库文库 cDNAmRNA逆转录的产物逆转录的产物基因组文库构建cDNA文库构建原原位位菌菌落落杂杂交交 6.原位组织杂交原位组织杂交 检测样本中组织、细胞特异性（基因检测样本中组织、细胞特异性（基因在细胞、组织中真实的表达情况）在细胞、组织中真实的表达情况） 靶分子靶分子组织、细胞中的组织、细胞中的RNA 探针探针标记的标记的DNA 可检测基因在不同时期、不同组织、可检测基因在不同时期、不同组织、不同部位的表达情况不同部位的表达情况基因表达的组基因表达的组织、细胞特异性。织、细胞特异性。 待检测组织待检测组织 固定固定 石蜡包埋石蜡包埋 显微观察显微观察 切片切片 杂交、检测杂交、检测 贴片贴片 脱蜡脱蜡7.基因芯片技术基因芯片技术 genechip，microarray 将探针固定在膜或其它介质上，将待将探针固定在膜或其它介质上，将待检测的组织检测的组织DNA（RNA）标记，与探针标记，与探针进行杂交，一次可检测一个样品上的多进行杂交，一次可检测一个样品上的多种信息。（高通量的检测方法）种信息。（高通量的检测方法） 芯片芯片 反相杂交反相杂交应用：应用：1.1.基因功能研究基因功能研究 不同时期的基因表达谱不同时期的基因表达谱 2.2.临床检测临床检测 3.3.药物筛选及评价药物筛选及评价 肽核酸肽核酸(PNA, peptide nucleic acid) 90年代丹麦科学家发明的一种全新年代丹麦科学家发明的一种全新 的的DNA类似物类似物，以肽键取代了，以肽键取代了DNA中的中的戊糖磷酸二酯键骨架。戊糖磷酸二酯键骨架。 特点：特点：1.1.可以通过碱基配对形成稳定的双螺可以通过碱基配对形成稳定的双螺旋结构旋结构 ； 2.2.不带负电荷，与不带负电荷，与DNADNA和和RNARNA之间不存在静之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；提高； 3. PNA3. PNA与与DNADNA或或RNARNA的杂交不受杂交体系盐的杂交不受杂交体系盐浓度影响，表现出较高的杂交稳定性、特异浓度影响，表现出较高的杂交稳定性、特异性好；性好； 4.4.不被核酸酶和蛋白酶水解不被核酸酶和蛋白酶水解 。应用：应用： 用于抑制基因表达的反义药物研究用于抑制基因表达的反义药物研究 用于用于DNA分子识别和操纵。（分子分子识别和操纵。（分子杂交、原位杂交、突变分析、抗癌、抗杂交、原位杂交、突变分析、抗癌、抗病毒反义核酸研究）病毒反义核酸研究） 取代寡核苷酸用于基因芯片的制备取代寡核苷酸用于基因芯片的制备